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        溫膽湯對脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)基因Adiponectin和LDLR甲基化的影響*

        2014-08-29 06:17:32楊海燕王萍
        江西中醫(yī)藥 2014年11期
        關(guān)鍵詞:溫膽湯脂聯(lián)素高脂

        ★ 楊海燕 王萍*

        (江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006)

        溫膽湯是中醫(yī)治療痰證的名方,臨床上用于治療肥胖及相關(guān)疾病具有較好療效[1]。以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與了肥胖、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等許多復(fù)雜疾病的形成和發(fā)展[2]。中醫(yī)是否可以通過干預(yù)DNA甲基化狀態(tài)達(dá)到調(diào)整機(jī)體的作用是很值得探討的問題。脂聯(lián)素(Adiponectin)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)均參與脂質(zhì)代謝,與肥胖及相關(guān)疾病的形成有很大關(guān)聯(lián)。本研究即探討溫膽湯對脂聯(lián)素和低密度脂蛋白受體啟動子甲基化狀態(tài)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 大鼠肥胖模型制作 選擇SPF級SD雄性大鼠50只,體重(60±10)g,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2013-0004。大鼠隨機(jī)分為兩組,即高脂飼料喂養(yǎng)組(簡稱高脂組)和基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組(簡稱正常組),其中高脂組30只,正常組20只。高脂組大鼠從購入起即進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料由100g基礎(chǔ)飼料中加入豬油15g、蛋黃粉10g、全脂奶粉15g、豬膽鹽0.5及濃縮魚肝油適量組成[3]。各組大鼠分別喂養(yǎng)4周后,淘汰體重過大或過小的大鼠,其中高脂組納入20只,正常組納入10只。高脂組入選大鼠的體重要符合肥胖模型的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

        1.2 藥物干預(yù) 上述大鼠肥胖模型制作成功后,高脂組大鼠隨機(jī)分為兩組,每組10只,兩組均停止高脂飼料喂養(yǎng),采用基礎(chǔ)飼料繼續(xù)喂飼。其中一組高脂組大鼠用溫膽湯灌胃干預(yù)1個月(溫膽湯組),另一組采用飲用水灌胃(模型對照組)。另有正常組10只,也采用飲用水灌胃(正常對照組)。溫膽湯(陳皮10g、法半夏10g、茯苓10g、竹茹10g、炒枳實6g、炙甘草3g、生姜3g、大棗5g)各組成藥物以中藥配方顆粒劑進(jìn)行配置,由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)。臨用時把各顆粒劑放入容器中,加熱水溶解,制成1g/mL生藥濃度。溫膽湯劑量采用人臨床生藥折算劑量5.5g/kg的2倍劑量11g/kg。

        1.3 DNA提取 溫膽湯干預(yù)1個月后,分別處死3組大鼠,獲取腎周脂肪組織提取DNA。DNA提取采用高脂肪組織基因組DNA提取試劑盒(Solar-bti),提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.4 DNA甲基化特異性PCR檢測 DNA進(jìn)行純度檢測合格后,采用EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)與瓊脂糖電泳。DNA甲基化PCR引物設(shè)計采用urogene網(wǎng)站在線設(shè)計優(yōu)化。

        脂聯(lián)素(Adiponectin)甲基化引物參數(shù)為:Left M primer,Start 1798,Size 25,Tm 59.11,GC% 56.00,'C's 5,Sequence TAAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGC;Right M primer,Start 2009,Size 24,Tm 58.61,GC% 54.17,'C's 4,Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCG;Product size:212, Tm:68.9。

        Left U primer,Start 1799, Size 25, Tm 59.00, GC% 60.00,'C's 5,Sequence AAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGTG;Right U primer,Start 2009,Size 25,Tm 57.74,GC% 56.00,'C's 4,Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCAC;Product size:211, Tm:68.1。

        低密度脂蛋白受體(LDLR)甲基化引物參數(shù)為:Left M primer,Start 660,Size 23,Tm 59.72,GC% 65.22,'C's 5,Sequence TTGTTAAGCGAGGGAGTTGTTAC;Right M primer,Start 849,Size 25,Tm 57.64,GC% 52.00,'C's7,Sequence ACCAAAATTCAATATCAAATATTCG; Product size:190,Tm:59.6。

        Left U primer,Start 660,Size 25,Tm 58.27,GC% 64.00,'C's 5,Sequence TTGTTAAGTGAGGGAGTTGTTATGT;Right U primer,Start 847,Size 25,Tm 56.03, GC% 52.00,'C's 6,Sequence CAAAATTCAATATCAAATATTCACC;Product size:188,Tm:59.5。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料采用IBM SPSS statistics 19統(tǒng)計軟件進(jìn)行卡方檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果 樣本的DNA純度較好,可以滿足甲基化PCR的要求。DNA純度判斷標(biāo)準(zhǔn):OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)。

        2.2 脂聯(lián)素啟動子甲基化PCR結(jié)果 分別比較溫膽湯組、模型對照組和正常對照組間腎周脂肪組織脂聯(lián)素啟動子的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示,大鼠腎周脂肪脂聯(lián)素基因存在著三種甲基化狀態(tài),即甲基化(M+,U-)、未甲基化(M-,U+)和不完全甲基化(M+,U+)。其中溫膽湯組甲基化3例,非甲基化4例和不完全甲基化3例;模型對照組甲基化5例,非甲基化2例,不完全甲基化3例;正常對照組甲基化2例,非甲基化6例,不完全甲基化2例,見表1。若把甲基化和不完全甲基化同歸為可能的甲基化狀態(tài),則溫膽湯組甲基化狀態(tài)為6例,模型對照組甲基化狀態(tài)為8例,正常對照組甲基化狀態(tài)為4例,見表2。采用卡方檢驗的fisher精確法檢測結(jié)果顯示,三組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P﹥0.05)。

        表1 脂聯(lián)素基因啟動子甲基化結(jié)果

        表2 三組間脂聯(lián)素基因啟動子甲基化的比較

        2.3 大鼠LDLR啟動子區(qū)經(jīng)預(yù)測無CpG島,考慮到人的LDLR啟動子區(qū)有CpG島,仍以urogene網(wǎng)站推薦基因甲基化PCR引物進(jìn)行嘗試研究,未能獲得可信結(jié)果。

        3 討論

        表觀遺傳學(xué)認(rèn)為,基因啟動子區(qū)的甲基化可能導(dǎo)致基因的表達(dá)受抑制[5]。本研究結(jié)果顯示,高脂飲食導(dǎo)致的大鼠肥胖模型中,與代謝紊亂有關(guān)的基因(如脂聯(lián)素)可能存在著啟動子甲基化狀態(tài)的改變。也就是說,高脂肥胖大鼠模型可能與調(diào)節(jié)代謝的基因表達(dá)改變有關(guān)。本研究結(jié)果即表明,脂聯(lián)素在高脂模型中存在著啟動子區(qū)甲基化的趨勢,盡管從統(tǒng)計學(xué)上并無顯著性差異,但這一趨勢值得進(jìn)一步探索。溫膽湯作為中醫(yī)治療痰證的名方,對改善脂質(zhì)代謝紊亂的肥胖具有較好的療效。本研究發(fā)現(xiàn),溫膽湯可能可以逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài),這也可能是其發(fā)揮療效的作用點。大鼠LDLR的啟動子區(qū)雖然沒有發(fā)現(xiàn)CpG島,甲基化的可能性較小。但啟動子區(qū)有時并不僅僅存在于轉(zhuǎn)錄基因之前的序列,也會存在轉(zhuǎn)錄序列之間。所以,高脂飲食導(dǎo)致的肥胖模型是否伴隨著啟動子區(qū)等序列的甲基化狀態(tài)改變,還需要深入研究。更應(yīng)該注意的是,人類的LDLR啟動子區(qū)是存在著CpG島的,這就需要在臨床研究中去探討此類問題。

        現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),包括脂聯(lián)素和低密度脂蛋白受體等在內(nèi)的諸多基因的甲基化狀態(tài)改變,與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。如在一項針對動脈粥樣硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn),AS患者存在著低密度脂蛋白受體的甲基化[6]。而肥胖對孕婦的脂聯(lián)素基因的甲基化模式也有影響[7]。

        中醫(yī)的病證發(fā)生發(fā)展可能與表觀遺傳學(xué)等機(jī)制有關(guān)聯(lián)[8],而中醫(yī)藥干預(yù)疾病的機(jī)制多樣,對表觀遺傳學(xué)機(jī)制的影響也可能是其中一環(huán)。但目前這方面的研究報道不多,是值得關(guān)注的領(lǐng)域。

        [1]連東輝.加味溫膽湯治療痰濕壅盛型肥胖性高血壓病60例[J].河南中醫(yī),2012,32(7):913-914.

        [2]張林,胡茂清.表觀遺傳和肥胖[J].中國糖尿病雜志,2013,21(4):376-378.

        [3]王磊,陳虹.幼年雄性SD大鼠營養(yǎng)性肥胖模型的建立[J].中國藥業(yè),2010,19(17):6-7.

        [4]Chandler PC, Viana JB, Oswald KD, et al.Feeding response to melanocortin agonist predicts preference for and obesity from a high-fat diet[J].Physiol Behav,2005,85(2):221-230.

        [5]史玉杰,李慶賀,劉曉輝.DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2013,33(7):90-96.

        [6]智艷芳,黃彥生,李著華,等.動脈粥樣硬化病人LDL受體基因啟動子序列的高甲基化改變[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報,2007,40(6):419-427.

        [7]Haghiac M, Basu S, Presley L,et al.Patterns of Adiponectin Expression in Term pregnancy: Impact of Obesity[J].J Clin Endocrinol Metab,2014, 99(9): 3 427-3 434.

        [8]王萍,楊海燕,王麗萍,等.從表觀遺傳學(xué)開展復(fù)雜性疾病證候本質(zhì)的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(5):1 208-1 210.

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