韓絲銀，宋文東，郭 健，紀(jì)麗麗，谷長(zhǎng)生

(1.廣東海洋大學(xué) a.食品科技學(xué)院;b.理學(xué)院,廣東 湛江 524088；2.浙江海洋學(xué)院 a.石化與能源工程學(xué)院;b.食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000；3.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

·研究論文·

4-咪唑苯甲酸合鎂配合物的合成及其生物活性*

韓絲銀1a，宋文東2a，郭 健2b,3，紀(jì)麗麗3，谷長(zhǎng)生1b

(1.廣東海洋大學(xué) a.食品科技學(xué)院;b.理學(xué)院,廣東 湛江 524088；2.浙江海洋學(xué)院 a.石化與能源工程學(xué)院;b.食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000；3.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

以4-咪唑苯甲酸和硝酸鎂為原料，利用水熱法合成了一種新型的金屬鎂配合物[Mg(C10H11N2O4)2(1)]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-單晶衍射表征。1屬六配位，單斜晶系，P2(1)/c空間群，晶胞參數(shù)a=12.194(3)?，b=10.943(3)?，c=7.915(2)?，β=97.043(6)°，V=1048.1(5)?3，R1=0.0842,wR2=0.1939。生物活性測(cè)試結(jié)果表明：1能降低馬氏珠母貝的死亡率，增強(qiáng)馬氏珠母貝外套膜上堿性磷酸酶酶活，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌有較強(qiáng)的抑制作用。在用藥量為312μg·mL-1時(shí)，1對(duì)三種菌的MIC分別為625μg·mL-1,625μg·mL-1和312μg·mL-1。

4-咪唑苯甲酸鎂；配合物；合成；生物活性

馬氏珠母貝是我國(guó)主要的海水育珠貝[1]，近年來(lái)，為了不斷提高所育珍珠的價(jià)值，諸多學(xué)者對(duì)馬氏珠母貝外套膜中與珍珠形成密切相關(guān)的堿性磷酸酶(ALP)進(jìn)行了大量研究。結(jié)果表明，ALP酶活性會(huì)因環(huán)境中金屬離子的不同及其濃度的不同而產(chǎn)生較大差異，尤其是Zn2+和Mg2+對(duì)ALP酶活性的影響更為顯著[2-5]，但是未發(fā)現(xiàn)有含鎂金屬配合物對(duì)ALP酶活性影響的文獻(xiàn)報(bào)道。而海水環(huán)境中有常見(jiàn)的三種細(xì)菌(沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和副溶血弧菌)，其大量生長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重阻礙馬氏珠母貝的正常代謝，導(dǎo)致死亡率升高。因此不斷的提取合成有生物活性的化合物，并研究其對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活性影響以及抑菌性能，降低馬氏珠母貝的死亡率，積極促進(jìn)它的育珠過(guò)程有十分重要的意義。

咪唑及其衍生物的金屬配合物具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、磁性、催化和生物活性,而且具備復(fù)合高分子的特點(diǎn),在應(yīng)用新材料、分子識(shí)別和超分子自組裝等方面有廣闊的應(yīng)用前景[6-10]。設(shè)計(jì)合成具有多種功能性、結(jié)構(gòu)新穎的金屬配合物成為近年來(lái)超分子配位聚合物研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)之一。目前關(guān)于4-咪唑苯甲酸的金屬配合物與生物活性的研究尚少，筆者在耿文倩[11]對(duì)4-咪唑苯甲酸有機(jī)錫配合物研究的基礎(chǔ)上，以4-咪唑苯甲酸和硝酸鎂為原料，利用水熱法合成了一種新型的金屬鎂配合物[Mg(C10H11N2O4)2(1)]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-單晶衍射表征。并研究了1的生物活性。

1的合成，為進(jìn)一步深入研究4-咪唑苯甲酸與不同金屬進(jìn)行配位后配合物的生物活性提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Bruker Smart 1000CCD型單晶衍射儀。

4-咪唑苯甲酸，濟(jì)南恒化科技有限公司；硝酸鎂，廣州化學(xué)試劑廠；馬氏珠母貝，湛江市徐聞縣；ALP測(cè)定試劑盒，南京建成生化有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1．2 1的合成

在反應(yīng)瓶中加入4-咪唑苯甲酸37.6mg(0.2mmol),硝酸鎂51.3mg(0.2mmol)和水15mL，攪拌使其溶解;用20%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 7.0，超聲震蕩25min得溶液A。

在25mL內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)加入溶液A，置程序控溫干燥箱中，設(shè)定3個(gè)反應(yīng)階段:(1)3h內(nèi)將溫度升至150℃;(2)于150℃晶化96h；以5℃·min-1速率降至室溫。開(kāi)釜,過(guò)濾,濾餅干燥得無(wú)色片狀晶體1，收率47%。

1．3 晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定

將1(0.33mm×0.28mm×0.22mm)置單晶衍射儀上，采用石墨單色化MoKα射線(λ=0.71073?)，在296.2K下，以ω掃描方式，根據(jù)晶體的類別、大小和衍射強(qiáng)度等設(shè)定衍射實(shí)驗(yàn)時(shí)所需時(shí)間，在219°～27.47°內(nèi)收集衍射點(diǎn)數(shù)據(jù)。

晶體結(jié)構(gòu)分析在PC上用SHELX97(Sheldrick,2008)程序系統(tǒng)完成。1的衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和經(jīng)驗(yàn)吸收校正，采用直接法，并經(jīng)數(shù)輪差值Fourier合成，找到全部非氫原子，對(duì)全部非氫原子及各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正，H2O上的氫原子由差值Fourier合成法得到，其它氫原子坐標(biāo)采用幾何加氫法得到。

1.4 馬氏珠母貝死亡率的測(cè)定

挑選完整、規(guī)格均勻、閉殼肌有力的馬氏珠母貝個(gè)體，剔除附著生物，采用課題組研制的室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)[12]進(jìn)行養(yǎng)殖。每個(gè)缸放養(yǎng)30只貝，用打氧機(jī)充入足夠的氧氣，每天8點(diǎn)～18點(diǎn)投喂螺旋藻粉。低劑量組每天添加250mg的1，高劑量組每天添加500mg的1，不添加1的劑量組為對(duì)照組，每半個(gè)月?lián)Q一次海水，每10天對(duì)各組的死亡率進(jìn)行檢測(cè)計(jì)算。

1．5 對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活力的測(cè)定

以去離子水為溶劑，配制c為(10，15，20，25，30，40，50，60)μg·mL-1的溶液。取8份生長(zhǎng)狀況相同的馬氏珠母貝外套膜組織0.5g，分別將其浸泡在上述溶液中30min。取出組織加入少量冷生理鹽水，勻漿，離心，取上清液稀釋成1%的組織勻漿上清液，用ALP測(cè)定試劑盒測(cè)定其ALP酶活力。

1．6 抑菌活性測(cè)定

通過(guò)酶標(biāo)儀法[13-14]測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線以評(píng)價(jià)1對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌的抑制活性。

(1)菌種活化：在燒杯中加入牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g及蒸餾水50mL，加熱攪拌使其完全溶解得溶液B；在鋁鍋中加入蒸餾水500mL，攪拌下加入溶液B和氯化鈉5g，邊加熱邊攪拌調(diào)至pH 7.2，置于滅菌鍋內(nèi)于121℃滅菌30min。在無(wú)菌條件下，將斜面保藏的菌種在超凈工作臺(tái)里連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次，取活化后的新鮮菌液離心棄去營(yíng)養(yǎng)肉湯，用磷酸緩沖液依次做10倍梯度稀釋，取c為1．0×108CFU·mL-1菌懸液備用。

(2)紫外-可見(jiàn)區(qū)吸收曲線掃描：用適量的DMSO溶解15mg，以空白溶劑作為參比，在200nm～800nm掃描。

(3)96孔板-菌懸液的準(zhǔn)備及OD值的測(cè)定：取相同生長(zhǎng)期的3種受試菌(大腸桿菌、巴氏桿菌、副溶血弧菌，c為1．0×108CFU·mL-1)各10μL，分別加到250μL含有不同濃度樣品的NB溶液中混勻，然后轉(zhuǎn)移到96孔板上，以僅含液態(tài)培養(yǎng)基作為參比，以相同體積不含樣品的菌懸液作為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在600nm處連續(xù)測(cè)定其吸光值(OD)。測(cè)定后用保鮮膜將96孔板封好，罩上錫箔紙，防止培養(yǎng)過(guò)程中水分蒸發(fā)和外界污染，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2h測(cè)定并記錄菌懸液的OD，直至細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期[15-16]。

2 結(jié)果與討論

2．1 晶體結(jié)構(gòu)

1的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，主要的鍵長(zhǎng)和鍵角見(jiàn)表1。從圖1可見(jiàn)，1為單核六配位結(jié)構(gòu)，中心鎂離子分別與兩個(gè)咪唑苯甲酸配體中咪唑基N原子相配位，其他四個(gè)配位鍵由配位水占據(jù)，配體通過(guò)氨基氮原子參加配位，1通過(guò)分子間的氫鍵以及π-π堆積作用將其連接成了一個(gè)三維超分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 1的分子結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Molecular structure of 1

表1 1的部分鍵長(zhǎng)和鍵角Table1 Selected bond lengths and angles of 1

晶體結(jié)構(gòu)解表明，1屬六配位，單斜晶系，P2(1)/c空間群，晶胞參數(shù)a=12.194(3)?，b=10.943(3)?，c=7.915(2)?，β=97.043(6)°，Z=2，V=1048.1(5)?3，R1=0.0842,wR2=0.1939。

2．2 生物活性

(1)1對(duì)馬氏珠母貝死亡率的影響

1對(duì)馬氏珠母貝死亡率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，添加1的馬氏珠母貝死亡率，比對(duì)照組明顯降低，且高劑量組的死亡率低于低劑量組。由此可見(jiàn)，1可以有效降低室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)養(yǎng)殖馬氏珠母貝的死亡率，通過(guò)進(jìn)一步的活性試驗(yàn)我們可以初步探究其作用機(jī)理。

Time/d

c/μg·mL-1

(2)1對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活力的影響

1對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活力的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，在一定的試驗(yàn)范圍內(nèi)，1對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活力有顯著的增強(qiáng)作用，當(dāng)c<30μg·mL-1時(shí)，隨著c的增加，酶活力都呈顯著增強(qiáng)趨勢(shì)，在c為30μg·mL-1時(shí)達(dá)到最大值(192.66%);當(dāng)c>30μg·mL-1時(shí)，隨著c的增大，酶活力急劇下降，而具體作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

Time/h Time/h Time/h

(3)抑菌活性

1的抑菌活性見(jiàn)圖4。從圖4可見(jiàn)，含有1的受試菌的生長(zhǎng)與空白對(duì)照組比較，皆受到不同程度的抑制，并且c(1)的升高，三種菌的光密度值相對(duì)空白對(duì)照組越來(lái)越低，即生長(zhǎng)受到的抑制越來(lái)越嚴(yán)重。1對(duì)三種菌菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，當(dāng)c為625μg·mL-1時(shí)，能夠完全抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)；當(dāng)c為312μg·mL-1時(shí)，能夠完全抑制副溶血弧菌生長(zhǎng)，即1對(duì)三種菌的MIC分別為625μg·mL-1，625μg·mL-1和312μg·mL-1。

3 結(jié)論

利用水熱合成法合成了一種新型的化合物4-咪唑苯甲酸合鎂(1)。1呈現(xiàn)為單核六配位結(jié)構(gòu)，每分子中含有兩個(gè)4-咪唑苯甲酸配體，配體通過(guò)氨基氮原子參加配位。在室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)養(yǎng)殖中，1可以有效降低馬氏珠母貝的死亡率，主要是由于1的溶液對(duì)馬氏珠母貝外套膜ALP酶活性有顯著的增強(qiáng)作用，當(dāng)用藥量為30μg·mL-1時(shí)，ALP酶活性可高達(dá)原來(lái)的192.66%，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌有較強(qiáng)的抑制作用，MIC分別為625μg·mL-1，625μg·mL-1和312μg·mL-1。

藥物進(jìn)入到生物體內(nèi)后可以影響生物體一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)，本文初步探究了1對(duì)海洋生物馬氏珠母貝的生理活性影響，為更多新型金屬配合物的合成、活性研究以及新型海洋生物免疫增強(qiáng)藥物研究提供了理論依據(jù)。

[1] 曹占旺，王大鵬，甘西.馬氏珠母貝及海水珍珠的研究進(jìn)展[J].2009,40(12):1618-1622.

[2] 廖金花,陳清西.金屬離子對(duì)鮑魚(yú)堿性磷酸酶活力的影響[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào),(自然科學(xué)版),2004,B08:12-15.

[3] 趙欣平,舒暢,楊芳,等.金屬離子和脲對(duì)白蠟蟲(chóng)堿性磷酸酶的影響[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2002,45(3)：318-322.

[4] 劉存岐,王安利,王維娜,等.海水中幾種金屬離子對(duì)中國(guó)對(duì)蝦幼體體內(nèi)堿性磷酸酶和ATPase的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2001,4(25):298-303.

[5] 黃毅,唐云明.金屬離子有機(jī)溶劑對(duì)黃鱔堿性磷酸酶的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,20:8513-8515.

[6] White D M,Sormenberg J．Oxidation of triarylimidazoles.Structures of the photochromic and piezochromie dliners of triarylimidazyl radiealsl[J].J Am Chem Soe,1966,88(16):3825-3829.

[7] Wang Y T,Tang G M,Wei Y Q,etal.Two new nonlinear optical and ferroelectric three-dimensional metal-organic frameworks with an sqp-net[J].Cryst Growth Des,2010,10:25-28.

[8] Robson R,Abrahams B F,Batten S R,etal.Supramolecular architecture,Bein,T.,Ed.,ACS Symposium Series 499:AmericanChemical Society:Washington,DC,1992;Chapter 19.

[9] Zhuang J Z,Seino H,Mizobe Y．Crystal structure and magnetic properties of an octacyanom etalate-based three-dimensional tungstate(V)manganese(II)bimetallic assembly[J].Inorg Chem,2000,39:5095-5101．

[10] 山本明夫著,陳惠麟,陸熙炎譯.有機(jī)金屬化學(xué):基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

[11] 耿文倩.唑類苯甲酸有機(jī)錫配合物的設(shè)計(jì)合成及性質(zhì)研究[D].安徽：安徽大學(xué)，2011.

[12] 宋文東,紀(jì)麗麗,劉娟花等.一種室內(nèi)馬氏珠母貝育珠裝置[P].CN 202035381U，2011．

[13] 陳默,王志偉,胡長(zhǎng)鷹,等.酶標(biāo)儀法快速評(píng)價(jià)香蘭素的抑菌活性[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2009,35(5):63-66.

[14] Rehab Amin,Barbara Krammer,Nora Abdel-Kader,etal.Antibacterial effect of some benzopyrone derivatives[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2010,45(1):372-378.

[15] Fan R Z,Li S J，Song W D，etal.Diaquabis(5-carboxy-2-propyl-1H-imidazole-4-carboxylato-j2N3,O4)-nickel(II)tetrahydrate[J].Acta Cryst Section E66,2010：897-898.

[16] Li S J,Liu J H,Song W D,etal.Diaquabis(5-carboxy-2-propyl-1H-imidazole-4-carboxylato-k2N3,O4)cadmium(II)3.5-hydrate[J].Acta Cryst Section E66,2011：1175-1176.

SynthesisandBiologicalActivitiesofMetalMagnesiumComplexwith4-ImidazoleBenzoicAcid

HAN Si-yin1a, SONG Wen-dong2a，GUO Jian2b,3, JI Li-li3, GU Chang-sheng1b

(a.College of Food Science and Technology;b.College of Science,1．Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;a.College of Petrochemical and Energy Engineering;b.College of Food and Medical,2.Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316000,China；3.College of Environmental Science and Engineering,Donghua University,Shanghai 201620,China)

A novel magnesium complex[Mg(C10H11N2O4)2(1)] was synthesized by reaction of 4-imidazole benzoic acid with magnesium nitrate by hydrothermal synthesis method.The structure was characterized by single-crystal X-ray diffraction．1belongs to hexa-coordinate,crystallizes in the monoclinic system，space groupP2(1)witha=12.194(3)?，b=10.943(3)?，c=7.915(2)?，β=97.043(6)°，V=1048.1(5)?3，R1=0.0842,wR2=0.1939．The biological activities tests showed that 1can reducepinctadamartensii’smortality，enhance alkaline phosphatase enzyme activity in the pallium of pinctada martensii and have strong inhibitory effect onescherichiacoli,salmonellaandvibrioparahaemolyticus，MIC were 625μg·mL-1,625μg·mL-1and 312μg·mL-1,respectively.

4-imidazole benzoic acid magnesium;complex;synthesis;biological activity

2013-01-16;

2014-05-26

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2012020011054)

韓絲銀(1991-)，女，漢族，碩士研究生，主要從事海洋生物活性資源利用化學(xué)的研究。

宋文東，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:songwd60@163.com

O614．22

A

1005-1511(2014)04-0459-04