洪雷 魏素菊 劉巍 王俊艷 史健 姜達 劉鳳玲

·論著·

恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株增殖抑制及凋亡影響

洪雷 魏素菊 劉巍 王俊艷 史健 姜達 劉鳳玲

目的觀察恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株增殖抑制及凋亡的影響。方法取對數(shù)生長人胃癌SGC7901細胞株，分為對照組、41℃、42℃、43℃、44℃組，5組分別加入終濃度30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L、240 nmol/L、480 nmol/L紫杉醇，于水浴箱中分別水浴0.5 h、1 h、1.5 h，72 h后MTT法測定紫杉醇熱化療對SGC7901胃癌細胞株細胞抑制作用并確定最佳紫杉醇濃度及熱療溫度、熱作用時間。流式細胞術分別檢測對照組、恩度組(15 mg/L)，紫杉醇熱化療組，恩度聯(lián)合組(恩度+紫杉醇熱化療)的細胞凋亡率并進行細胞周期分析。結果隨著紫杉醇濃度以及溫度的提高，SGC7901細胞株的抑制率逐步升高。在紫杉醇濃度480 nmol/L、43℃作用1 h條件下，SGC7901細胞株的抑制率達到70.99%，在各組最高。細胞凋亡率在對照組、恩度組、紫杉醇熱化療組以及聯(lián)合治療組分別為0.70%、1.48%、8.56%、12.97%。細胞周期分析可見與對照組相比恩度組的增殖期(S+G2/M)細胞比例由(52.5±2.1)%下降到(42.3±2.0)%(P<0.05)，紫杉醇熱化療組G2/M期細胞比例由(15.2±1.4)%上升至(32.1±2.2)%(P<0.05)。與紫杉醇熱化療組相比，恩度聯(lián)合治療組的G2/M期細胞比例由(32.1±2.2)%下降到(19.9±1.3)%，而G1期比例由(30.5±1.7)%上升到(48.1±2.4)%(P<0.05)。結論43℃熱作用1 h聯(lián)合480 nmol/L紫杉醇對人胃癌SGC7901細胞株增殖抑制作用在5組中最強，紫杉醇熱化療聯(lián)合恩度后能夠進一步增加對SGC7901胃癌細胞株的抑制作用，并誘導其凋亡。

恩度；紫杉醇；熱化療；胃腫瘤；SGC7901細胞株

胃癌是當今世界范圍內發(fā)病和死亡最常見的惡性腫瘤之一。胃癌起病隱匿，確診時很多患者已屬晚期，喪失了手術治療的機會，而傳統(tǒng)化療療效有限，因此尋找行之有效的聯(lián)合治療方法一直是臨床工作的的重點。本實驗通過MTT法檢測紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株的抑制作用，通過流式細胞學檢測探討恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人胃癌SGC7901細胞株由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供。恩度(先聲藥業(yè))，紫杉醇注射液(江蘇揚子江藥業(yè))。DMSO(上海索萊寶生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清(PAA Laboratories GmbH)，四甲基偶氮唑藍(美國SIGMA公司)。流式細胞儀(Epics-XLⅡ型 美國BC公司)，96孔細胞培養(yǎng)板(NEST biotechCo.,Ltd)，低溫超速離心機，紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將人胃癌SGC7901細胞株置于pH值7.2～7.4的DMEM培養(yǎng)液(終濃度為：10%胎牛血清，青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)中，于37%、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞呈貼壁生長，形態(tài)良好無退化，待其鋪滿瓶壁70%～80%時以0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，每日換液。取對數(shù)生長期的人胃癌SGC7901細胞株，制成5×105/ml的細胞懸液備用。

1.2.2 MTT法檢測紫杉醇聯(lián)合熱療對細胞增殖影響：按照溫度分為41℃、42℃、43℃、44℃ 4組。取已準備好的人胃癌SGC7901細胞株單細胞懸液，以5×105/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。標準條件培養(yǎng)過夜后，加入新的培養(yǎng)液或含實驗藥品的培養(yǎng)液，實驗用紫杉醇終濃度分別為：30、60、120、240、480 nmol/L，每孔100 μl。分別于41℃、42℃、43℃、44℃水浴箱孵育0.5、1、1.5 h后，置于37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，于培養(yǎng)結束前4 h，各孔加入(5 mg/ml)的MTT溶液(MTT溶于磷酸鹽緩沖液)20 μl；培養(yǎng)結束后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，避光震蕩10 min，于全自動酶標儀檢測各孔光密度值(OD 492 nm)，并按公式抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值計算抑制率。每組獨立實驗均至少重復3次。結果取平均值。

1.2.3 流式細胞學檢測藥物對人胃癌SGC7901細胞株凋亡的影響及細胞周期分析：取對數(shù)生長期的人胃癌SGC7901細胞株，按不同處理分4組：對照組、恩度組、恩度+紫杉醇+熱療(43℃，1 h)組；紫杉醇+熱療(43℃，1 h)組。其中恩度終濃度為：15 mg/L[1]，紫杉醇注射液終濃度：480 nmol/L；培養(yǎng)72 h后，將懸浮細胞收集到10 ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為(2～5)×106，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

細胞周期分析：根據細胞活力測定結果，選擇1 μmol/L的HCPT處理細胞。收集(2～5)×106個細胞，用PBS 洗滌2次后，重懸于500 μl的PBS中，加入4℃乙醇固定12 h以上。離心除去乙醇，用PBS重懸洗滌，離心去PBS，加入碘化丙啶(PI)染色，室溫避光20 min，上流式細胞儀檢測DNA含量和細胞周期，資料用Modfit軟件分析。每組實驗設3個平行樣，實驗重復3次。

細胞凋亡分析：以不含EDTA的胰酶消化收集1×106個經藥物處理的SCG7901細胞，PBS洗滌兩次后重懸于binding buffer，加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后再加入5 μl 的PI混勻，室溫避光反應5～10 min，上機檢測細胞凋亡率。每組實驗設3個平行樣，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，MTT結果各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時用最小顯著差法，方差不齊時采用非參數(shù)統(tǒng)計中的H檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株細胞活性抑制作用 在41℃、42℃、43℃、44℃，SGC7901胃癌細胞株在熱作用0.5、1、1.5 h后72 h，細胞抑制率會隨著紫杉醇濃度的增加而增加，較對照組有明顯差異(P<0.05)。紫杉醇各濃度下，在41℃、42℃、43℃，熱作用72 h后細胞增殖抑制率會隨著熱作用時間的延長而增高，其中熱作用1 h的抑制率最高，而在作用1.5 h出現(xiàn)抑制率下降的現(xiàn)象。44℃組各條件下，細胞增殖抑制率均較43℃組有所下降。最高抑制率出現(xiàn)在藥物濃度480 nmol/L，43℃作用1 h條件下。對紫杉醇480 nmol/L，熱作用1 h的不同溫度組進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)43℃組與41℃組存在差異(P<0.05)，42℃組與41℃組存在差異(P<0.05)，其余各組間未見明顯差異(P>0.05)。但43℃組在各濃度時的細胞抑制率均優(yōu)于42℃組。因此我們選定43℃，熱作用1 h，紫杉醇濃度480 nmol/L作為進行進一步實驗的條件。見圖1。

2.2 FCM法檢測恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對人胃癌SGC7901細胞株凋亡的影響及細胞周期變化 對SGC7901胃癌細胞株分組處理72 h后，細胞凋亡率在對照組、恩度組、紫杉醇熱化療組以及聯(lián)合治療組分別為0.70%、1.48%、8.56%、12.97%。在紫杉醇熱療組以及聯(lián)合治療組可見凋亡峰。細胞周期分析可見與對照組相比恩度組的增殖期(S+G2/M)細胞比例由(52.5±2.1)%下降到(42.3±2.0)%，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。紫杉醇熱化療組體現(xiàn)典型G2/M期阻滯圖形，與對照組相比G2/M期細胞比例由(15.2±1.4)%上升至(32.1±2.2)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與紫杉醇熱化療組相比，恩度聯(lián)合治療組的G2/M期細胞比例由(32.1±2.2)% 下降到(19.9±1.3)%，而G1期比例由(30.5±1.7)%上升到(48.1±2.4)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖1 熱作用1 h，各紫杉醇濃度下41℃、42℃、43℃組細胞增值抑制率

圖2 FCM細胞凋亡率測定

圖3 FCM細胞周期測定

3 討論

紫杉醇是循證醫(yī)學證實的胃癌一線化療藥物，在進展期胃癌的治療中具有重要的地位。紫杉醇可以同時結合微管蛋白的α端和β端，從而使微管蛋白聚合，阻止紡錘體的形成，中止有絲分裂，抑制G2期細胞向M期轉化而達到抗腫瘤細胞的效果。熱療是通過物理加熱并作用于腫瘤一定時間來治療腫瘤的一種方法。腫瘤細胞具有熱敏感性，與正常組織細胞具有不同的熱耐受性，其中以S期細胞對熱最為敏感[2]。從作用機制上講，紫杉醇與熱療具備協(xié)同增效作用。熱療可使細胞膜通透性改變，促使藥物進入腫瘤細胞，還可以抑制紫杉醇作用后細胞對 DNA損傷的修復，促進紫杉醇誘導的細胞凋亡。很多研究業(yè)已證實紫杉醇聯(lián)合熱療對于殺傷腫瘤細胞具備明顯的協(xié)同增效作用[3-5]。

41℃對癌細胞具有選擇性殺傷作用，而43℃熱作用1 h是殺傷癌細胞的有效劑量，加熱溫度控制在40.5℃～43℃使多數(shù)化療藥物的細胞毒作用達到最大[6]。本實驗設計41℃、42℃、43℃、44℃4個溫度組分別來觀察不同濃度紫杉醇熱化療對SGC9701的抑制作用。MTT結果顯示在作用1.5 h以及溫度44℃組均出現(xiàn)抑制率下降的現(xiàn)象，這與本實驗室的另外一個熱療實驗相符。從理論上講，雖然不同細胞對熱的敏感性存在差異，但隨著溫度增高以及熱作用時間的延長，細胞株的凋亡率應逐步增高。另外，雖然我們知道腫瘤細胞存在熱耐受現(xiàn)象，但從理論上講也是出現(xiàn)在第二次以后加熱時。因此分析有可能原因：(1)實驗操作問題影響結果；(2)是否存在其他熱耐受機制，即腫瘤細胞在溫熱過程中即出現(xiàn)熱耐受；(3)溫度變化對熱療與紫杉醇的協(xié)同作用的影響并非簡單的線性關系。我們剔除了44℃以及1.5 h數(shù)據，進一步探討其余3個溫度組的結果。紫杉醇聯(lián)合熱療對SGC7901胃癌細胞株細胞的抑制作用有著明顯的溫度、熱作用時間以及藥物濃度依賴性。通過對比熱作用1 h，41℃、42℃、43℃下人胃癌SGC7901細胞株的抑制率，我們發(fā)現(xiàn)隨著溫度增加，同一紫杉醇濃度下，細胞抑制率有逐步增高趨勢。這一趨勢提示，熱療聯(lián)合紫杉醇對細胞株抑制作用優(yōu)于單純紫杉醇以及單純熱療，聯(lián)合方法取得了更高的細胞抑制率。另外，曲線圖也提示我們，達到同一細胞抑制率水平，我們可以通過提高熱療溫度達到減少紫杉醇濃度的目的，這為將熱療在臨床應用中作為減毒、增效的方法提供了實驗依據。

恩度具有抑制血管內皮細胞增殖、 遷移、 分化，促進內皮細胞凋亡并對抗VEGF促進新生血管形成和增加血管通透性的作用。它毒性低，安全性高，因此是一個較為理想的聯(lián)合治療藥物。恩度是否對人胃癌SGC7901細胞株具有促進凋亡的作用，目前因實驗條件的差異而報道不一[1，7]。本實驗流式細胞學檢測凋亡率并未發(fā)現(xiàn)恩度有明顯促進凋亡的作用，但在細胞周期分析時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比恩度組細胞株增殖期(S+G2/M)細胞比例明顯下降，這說明恩度對該細胞株還是存在一定的增殖抑制的作用。從作用機制上講，恩度不屬于細胞毒性藥物，它通過抑制血管內皮細胞間接地達到抑制腫瘤的目的，雖然有些文獻提示它對部分腫瘤細胞有增值抑制、促進凋亡的作用，但整體的抑制作用以及促凋亡作用均不高，因此臨床上很少單獨應用恩度作為抗腫瘤手段。另外，恩度的半衰期較短，臨床治療中需要連續(xù)14 d持續(xù)靜脈注射且多療程治療才會達到相對好療效。因此，根據恩度的作用機制以及藥代謝動力學特點，也許調整給藥劑量或增加給藥頻次能提高恩度對癌細胞的抑制作用并促進癌細胞凋亡。

文獻報道恩度與紫杉醇聯(lián)合可以提高抗腫瘤作用[8-10]，但其與紫杉醇熱化療聯(lián)合能否進一步提高抗腫瘤作用，目前仍未有報道，因為我們并不明確熱作用是否會影響恩度的作用。本實驗流式細胞學細胞凋亡率分析結果提示：細胞凋亡率在對照組、恩度組、紫杉醇熱療組，以及聯(lián)合組呈現(xiàn)逐步增高趨勢，雖然恩度單藥未對SGC7901細胞株表現(xiàn)出明顯促凋亡作用，但當其與紫杉醇熱化療聯(lián)合時，其促凋亡作用較紫杉醇熱化療組有了明顯的提高。另外，細胞周期分析提示，在恩度聯(lián)合治療組的G1/M期細胞比例明顯下降，這表明紫杉醇熱化療加入恩度后，很有可能促進了G1/M期細胞的凋亡，恩度與紫杉醇熱化療間存在協(xié)同作用的機制，另外結果提示，熱作用下恩度可以發(fā)揮作用。

綜上所述，體外研究顯示，43℃熱作用1 h聯(lián)合480 nmol/L紫杉醇對人胃癌SGC7901細胞株增殖抑制作用在各組最強。恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療能夠進一步增加對SGC7901胃癌細胞株的抑制作用，并誘導其凋亡。

1 林萬隆,倪克樑,谷曉媛.恩度對SGC-7901人胃癌細胞殺傷效應及其機制的初探.中華腫瘤防治雜志,2009,21:1642-1645.

2 Ikeguchi M,Nakamura S,Kaibara N.Quantitative analysis of expression levels of bax,bcl-2,and survivin in cancer cells during cisplatin treatment.Oncol Rep,2002,9:1121-1126.

3 王承龍，張帥，趙素萍，等.紫杉醇聯(lián)合熱療對鼻咽癌CNE-1細胞株增殖及凋亡的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2009,6:844-848.

4 王承龍,張帥,黃東海，等.加熱聯(lián)合紫杉醇對人喉癌細胞Hep-2體外增殖抑制及凋亡的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,11:1311-1316.

5 高姍,王琳,吳衛(wèi)東，等.不同溫度熱療聯(lián)合紫杉醇化療對肺癌A549細胞生長及JNK磷酸化的影響.鄭州大學學報(醫(yī)學版),2008,3:459-462.

6 Urano M,Kuroda M,Nishimura Y.For the clinical applicationof thermochemotherapy at mild temperatures.Int J Hyperthemia,1999,15:79-107.

7 李迪諾,付曉光.重組人血管內皮抑制素對人胃癌細胞株SGC-7901表達VEGF的抑制作用.藥物生物技術,2010,17:308-311.

8 趙意,蔡開,劉燦，等.恩度聯(lián)合TP方案對食管癌細胞抑制作用的實驗研究.實用醫(yī)學雜志,2012,12:1963-1965.

9 申維喜,趙妍,閆玉，等.恩度聯(lián)合紫杉醇對Her-2過表達乳腺癌細胞的誘導凋亡研究.腫瘤學雜志,2012,11:844-847.

10 Rong B,Yang S,Li W,et al.Systematic review and meta-analysis of Endostar (rh-endostatin) combined with chemotherapy versus chemotherapy alone for treating advanced non-small cell lung.World J Surg Oncol,2012,10:170.

Effectofendostatincombinedwiththermo-chemotherapyofpaclitaxelontheproliferationandapoptosisofhumangastriccarcinomacellstrain-SGC7901invitro

HONGLei,WEISuju,LIUWei,etal.DepartmentofOncology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo observe the effect of endostatin combined with paclitaxel thermo-chemotherapy on the proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma cell strain (SGC7901) in vitro.MethodsThe SGC7901 cell strain at logarithmic growth phase was divided into five groups: control group,41℃,42℃,43℃,44℃groups,then paclitaxel in final concentration of 30nmol/L, 60nmol/L,120nmol/L,240nmol/L, 480nmol/L was added into different groups, respectively.The cells in different groups were maintained in water bath for 0.5h,1h,1.5h,72h.The MTT method was used to observe the inhibitory effect of paclitaxel thermo-chemotherapy on SGC7901 cell strain and to determine the optimal conditions including concentration of paclitaxel, temperature for thermotherapy and heating time. The apoptosis rate and the change of cell cycle in control group, endostatin group (15mg/L), paclitaxel thermo-chemotherapy group and combination treatment group (endostatin+paclitaxel thermo-chemotherapy) were detected by FCM.ResultsWith the increase of paclitaxel final concentration and temperature,the inhibitory rate of SGC7901cell strain was increasing gradually,which reached 70.99% in the final concentration of paclitaxel 480nmol/L for 1-hour water bath under 43℃,which was the highest among the groups. The cell apoptosis rates in control group, endostatin group, paclitaxel thermo-chemotherapy group and combination treatment group were 0.70%, 1.48%, 8.56%, 12.97%,respectively. The cell cycle analysis showed that the cell ratio at proliferative phase (S+G2/M) in endostatin group was decreased from (52.5±2.1)% to(42.3±2.0)%,as compared with that in control group (P<0.05), however,which in paclitaxel thermo-chemotherapy group at G2/M phase was increased from (15.2±1.4)% to (32.1±2.2)% (P<0.05). As compared with that in paclitaxel thermo-chemotherapy group,the cell ratio at G2/M phase in combination treatment group was decreased from(32.1±2.2)% to (19.9±1.3)%,however,which at G1 phase was increased from (30.5±1.7)% to(48.1±2.4)%(P<0.05).ConclusionThe inhibitory effect of thermo-chemotherapy for 1 hour combined with paclitaxel in final concentration of 480nmol/L on SGC7901 cell strain proliferation is the most powerful among groups,and paclitaxel thermo-chemotherapy combined with endostatin can enhance further the effect and can induce cell apoptosis of SGC7901 cell strain.

endostatin;paclitaxel;thermo-chemotherapy;gastric carcinoma;SGC7901 cell strain

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.002

050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤內科

R 735.2

A

1002-7386(2014)08-1128-04

2013-12-18)