馬振華　鄒春燕

【摘要】 目的 探討人白介素-17（IL-17）在幽門螺桿菌（HP）不同亞型菌株感染AGS細胞中的表達情況， 并探討可能的作用機制。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測IL-17的表達， 并分析其與HP不同亞型間的關(guān)系。結(jié)果 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， HP I型與II型感染AGS細胞24 h后比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， HP I型與II型感染AGS細胞48 h后比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 HP不同亞型均可誘導(dǎo)IL-17的表達， 且HP I型更易誘導(dǎo)IL-17的表達。

【關(guān)鍵詞】 幽門螺桿菌I型；幽門螺桿菌II型；AGS細胞；人白介素-17；酶聯(lián)免疫吸附法

【Abstract】 Objective To investigate the expression of interleukin-17（IL-17） in AGS cells which infected by strains of helicobacter pylori（HP） in different subtypes and explore the possible mechanism. Methods By enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） to detect the expression of IL-17， and to analyze its relationship with HP in different subtypes. Results HP type I and Type II infected AGS cells 24 h， 48 h and control group were significantly different（P<0.05）. There were obvious differences in 24 h after HP type I and type II infection in AGS cells， there were significant differences in comparison with 48 h after HP type I and type II infection in AGS cells（P<0.05）. Conclusion HP in different subtypes can induce the expression of IL-17， and type I can more easily induce the expression of IL-17.

【Key words】 Helicobacter pylori type I； Helicobacter pylori type II； AGS cells； Interleukin-17； Enzyme-linked immuno sorbent assay

幽門螺桿菌（HP）感染在慢性活動性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等各種胃腸道疾病中是一個至關(guān)重要的致病因素[1]。目前， 我國是HP感染率及胃癌的發(fā)病率最高的國家[2]。根據(jù)cag致病島的有無， 將HP分為I型和II型， I型包含cag致病島[3]。I型比II型更易誘導(dǎo)細胞形態(tài)的改變及更嚴重的炎癥反應(yīng)[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS細胞24 h， 48 h， 通過ELISA檢測IL-17的濃度， 進而討論HP不同分型對IL-17的誘導(dǎo)作用及機制。

1 資料與方法

1. 1 AGS細胞的培養(yǎng) 將AGS細胞（購買于中國科學院上海細胞研究所）接種至培養(yǎng)皿， 加入RPMI1640培養(yǎng)基， 放入37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。

1. 2 HP的培養(yǎng) 在微需氧環(huán)境下， HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株（美國ATCC公司）用哥倫比亞血瓊脂選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1. 3 HP不同菌株感染AGS細胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株處于對數(shù)生長期時， 分別取少許菌液涂片， 用PBS溶液將處于對數(shù)生長期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分別清洗2遍， 5000轉(zhuǎn)， 離心5 min；分別制備HP懸液。

AGS細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的80%時， 棄掉原培養(yǎng)基， 按細菌：細胞=100：1比例加入HP懸液， 放入37℃、5%CO2孵育箱共同培養(yǎng)24 h、48 h。

1. 4 ELISA

1. 4. 1 ELISA檢測IL-17濃度 IL-17酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購買自南京奧尼多福公司， 取出上述不同菌株感染的AGS細胞， 3000轉(zhuǎn)， 離心20 min。收集細胞上清， ELISA檢測IL-17濃度。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1. 4. 2 待測樣品濃度的計算 以O(shè)D值為縱坐標， 濃度為橫坐標， 做出標準曲線并求出曲線方程， 然后根據(jù)待測樣品的OD值在該曲線上求出相應(yīng)的IL-17濃度， 再乘以稀釋倍數(shù)5倍， 即待測樣品的濃度。

1. 5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析， 計量資料用均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 計數(shù)資料用率（%）表示， 采用χ2檢驗， P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用Bartlett檢驗對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。若方差齊， 兩個樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗。若方差不齊， 則采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2. 1 HP不同亞型菌株感染AGS細胞24 h、48 h后誘導(dǎo)IL-17的表達與空白對照組比較 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 HP不同亞型菌株誘導(dǎo)IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導(dǎo)多種細胞釋放炎癥介質(zhì)， IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān)， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關(guān)[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo)IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過上調(diào)腫瘤細胞及基質(zhì)細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產(chǎn)生， 發(fā)揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結(jié)果提示HP可誘導(dǎo)IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外， 大多數(shù)學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關(guān)[9]， 但本實驗結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導(dǎo)IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導(dǎo)IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導(dǎo)IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

參考文獻

[1] Kusters JG， van Vliet AH， Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinic Microbiology Rev， 2006， 19（4）：449-490.

[2] Zhu YL， Zheng S， Du Q， et al. Characterization of Cag A variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients. World J Gastroenterol， 2005， 11（8）：880-884.

[3] Covacci A， Rappuoli R. Helieobacter pylori：after the genomes， back to biology. J Exp Med， 2003， 197（1）：807.

[4] Correa P， Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome：Implications for Gastric carcinogenesis”. Cut Liver， 2012， 6（1）：21-28.

[5] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells. J Immunol ， 2010（184）：1630-1641.

[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫(yī)大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亞型菌株誘導(dǎo)IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導(dǎo)多種細胞釋放炎癥介質(zhì)， IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān)， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關(guān)[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo)IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過上調(diào)腫瘤細胞及基質(zhì)細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產(chǎn)生， 發(fā)揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結(jié)果提示HP可誘導(dǎo)IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外， 大多數(shù)學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關(guān)[9]， 但本實驗結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導(dǎo)IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導(dǎo)IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導(dǎo)IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

參考文獻

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[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫(yī)大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亞型菌株誘導(dǎo)IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-17濃度的比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見表2。

2. 3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后， IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子， 其可誘導(dǎo)多種細胞釋放炎癥介質(zhì)， IL-17不僅與炎性反應(yīng)密切相關(guān)， 亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關(guān)[5]。研究表明， IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用， 并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等[6]。同時， 亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導(dǎo)IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集， 此外， 中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過上調(diào)腫瘤細胞及基質(zhì)細胞IL-6的表達量， IL-6作用于STAT3途徑， 從而激活促癌基因的產(chǎn)生， 發(fā)揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成[7]。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高， 這與蘇濤[8]等研究一致， 實驗結(jié)果提示HP可誘導(dǎo)IL-17濃度表達， 從而加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果亦顯示， I型HP感染AGS細胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外， 大多數(shù)學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加， 且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關(guān)[9]， 但本實驗結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異， 這與上述觀點相悖， 有待進一步研究探討， 明確是否隨著時間的推移， IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述， 在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中， HP不同亞型菌株感染后所誘導(dǎo)IL-17的表達各不相同， 尤其I型HP是誘導(dǎo)IL-17濃度表達的重要因素， 充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導(dǎo)IL-17濃度表達的作用機制， 使IL-17可作為潛在治療靶點， 以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

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[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 蘇濤. IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義. 第四軍醫(yī)大學， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]