馬海寬，韓曉紅，張財華，張 旭，史曉鳳，馬 君

(中國海洋大學光學光電子實驗室， 山東 青島 266100)

0 引言

二十世紀三十年代，磺胺類抗生素被發(fā)現(xiàn)可有效治療感染性疾病后，被長期用于臨床治療[1]。近年來，磺胺類抗生素在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中的濫用對人體健康及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生嚴重的危害。目前國內外對磺胺類抗生素殘留的檢測方法主要包括理化檢測法、生物測定法及免疫分析法[2]。這些方法雖然靈敏度比較高，但是儀器和材料價格昂貴，操作復雜，很難實現(xiàn)現(xiàn)場探測。目前，急需一種可檢測水產(chǎn)品中殘留痕量抗生素的簡單、快速、便捷的方法。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技術具有簡單、快速、方便、高靈敏度、高準確度的痕量檢測等優(yōu)點，當檢測分子發(fā)生諧振時，增強效果可達1014-1015倍[3, 4]，在理論上可達到單分子檢測的水平，在多個領域已被廣泛應用。近年來，國內外多個研究小組相繼將SERS技術應用于對抗生素的檢測與分析，并取得了一定的成果。2006年，羅馬尼亞的Lliescu[5]等人利用銀溶膠作為增強基底對青霉素鉀進行了拉曼光譜探測。2011年，中國科學技術大學的陳乾旺[6]等人制備了空心金納米材料，并以此為增強基底對四環(huán)素溶液進行SERS光譜檢測，能夠檢測到的最低濃度為0.1 ppb。2013年，上海海洋大學的賴克強[7]等人用購買的Klarite材料作增強基底對魚肉中孔雀石綠和結晶紫進行SERS光譜探測，能夠檢測的最低濃度分別為10 ppb和15 ppb。2013年，中國海洋大學馬君[8]等利用自組裝法制備了銀溶膠膜，使用顯微拉曼系統(tǒng)對氯霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星進行了SERS光譜探測，最低檢測濃度分別為40 ppb、5 ppb、40 ppb。

本文通過制備高靈敏度的銀溶膠，探測分析了魚肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的SERS光譜，確定了提取上述物質的最佳提取方法，并計算了兩者在魚肉中的檢測限。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

氫氧化鈉、氨水、硝酸銀、檸檬酸三鈉、鹽酸、硝酸、無水硫酸鈉等均購于國藥集團化學試劑有限公司；水產(chǎn)品中限制使用的兩種磺胺類抗生素(磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶)由上海源葉生物科技有限公司提供；比目魚購自超市；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷來自天津科密歐化學試劑有限公司；去離子水為中國海洋大學化學學院自制。所有試劑和藥品均為分析純，使用時未進一步提純。

1.2 實驗儀器

磁力攪拌器(RCT basic，德國IKA公司)；超聲清洗器(KQ2200DB，昆山超聲儀器公司)；恒溫干燥箱(DHG-9037A，上海精宏實驗設備廠)；微波爐(MM823ESJ-PA，美的集團有限公司)；離心機(TG16-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；掃描電子顯微鏡(S-4800，日本日立公司)

光譜儀為美國Ocean optics公司生產(chǎn)的新一代QE65Pro便攜式拉曼光譜儀，光柵刻痕密度為900 g/mm，光譜分辨率為10 cm-1。光源采用VA-I-N532固體連續(xù)激光器，激發(fā)波長為532 nm，激光最大功率為400 mW。

1.3 實驗方法

1.3.1 銀溶膠的制備

將150 mL、0.02%的硝酸銀溶液放入微波爐中加熱[9]。溶液沸騰后，放入熱水浴中，900 r/min攪拌，同時緩慢加入4 mL、1%的檸檬酸鈉溶液，2 min后放回微波爐中繼續(xù)加熱9 min后取出冷卻至室溫。

1.3.2 標準溶液的配置及魚肉中抗生素的提取

以氨水、乙酸乙酯作為溶劑，分別配置濃度為50 ppm、30 ppm、20 ppm、15 ppm、12 ppm、10 ppm、8 ppm、5 ppm、2 ppm、1 ppm的磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶標準溶液待用。

為排除魚肉中脂肪和蛋白質等大分子對光譜的影響，魚肉中抗生素的提取方法非常重要。主要包括勻漿、離心、去脂、定容這四個步驟。首先，將1 g魚肉、1 mL抗生素標準溶液和提取劑混合，勻漿使魚肉與抗生素充分混合；再將勻漿后的混合物離心取出上清液，向殘渣中加入一定量的提取劑，重復提取一次，合并上清液；進一步將上清液水浴蒸發(fā)濃縮至近干，加入一定量的甲醇與正己烷，離心去除正己烷，以去除魚肉中油脂類物質；最后，用提取劑定容至10 mL，得待測物提取液。 4 ℃保存，用于SERS光譜測定。

2 實驗結果與結論

光譜數(shù)據(jù)分析采用Origin8.1軟件進行平滑和去基線處理，光譜探測時，到達樣品的激光功率為50 mW，積分時間為10 s，每個樣品探測五次進行平均。

2.1 銀溶膠的表征

經(jīng)微波加熱法制備的銀溶膠顏色為棕綠色，掃描電鏡圖(Scanning election microscope SEM)及紫外可見吸收光譜如圖1所示，可以看出銀納米顆粒是不規(guī)則的球狀，粒徑大小較為均勻，粒徑范圍在45-65 nm之間，吸收峰位于424 nm。

圖1 銀溶膠的掃描電鏡圖及消光光譜Fig.1 Scanning election microscope image and extinction spectrum of silver colloid solution

2.2 魚肉中抗生素的SERS探測

2.2.1 磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶固體拉曼光譜分析

從分子結構上看，磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶只在嘧啶環(huán)上相差一個甲基，為了分析其拉曼效應的異同，取少許磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶固體進行拉曼光譜的探測，圖2為獲得的典型光譜圖。

圖2 典型磺胺類抗生素固體拉曼光譜. (a) 磺胺甲基嘧啶; (b) 磺胺二甲基嘧啶Fig.2 Typical Raman Spectra of solid sulfonamide antibiotics. (a) sulfamerazine; (b) sulfamethazine

通過對比兩者的拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，其主要特征峰大致相似，分別為：1 636 cm-1(1 644 cm-1)、1 598 cm-1(1 598 cm-1)處的對位二取代苯環(huán)伸縮振動，1 512 cm-1(1 512 cm-1)、1 417 cm-1(1 417 cm-1)處的嘧啶環(huán)伸縮振動，1 374 cm-1(1 386 cm-1)的嘧啶環(huán)呼吸振動，842 cm-1(838 cm-1)、747 cm-1(719 cm-1)、685 cm-1(686 cm-1)處的對位二取代苯環(huán)呼吸振動。表1列出了磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶主要拉曼峰及其歸屬[10]。從表1可知磺胺甲基嘧啶相比磺胺二甲基嘧啶分別在1 564 cm-1、1 194 cm-1處出現(xiàn)了明顯的拉曼峰，依次代表嘧啶環(huán)的伸縮振動、嘧啶環(huán)的呼吸振動。分析原因，主要由于兩種物質分子結構上的差異，磺胺甲基嘧啶結構中嘧啶環(huán)為2,4-雙取代，而磺胺二甲基嘧啶中嘧啶環(huán)為2,4,6-三取代。嘧啶環(huán)中的2,4,6-三取代使得嘧啶環(huán)結構對稱性更好，影響了嘧啶的拉曼活性，從而影響嘧啶環(huán)的伸縮和呼吸振動，導致部分拉曼峰的缺失。

2.2.2 提取劑的確定

由于磺胺類抗生素易溶于部分有機溶劑和銨鹽溶液，實驗中分別以乙酸乙酯和pH=10的氨水作為抗生素標準溶液的溶劑和魚肉中抗生素的提取劑。實驗中發(fā)現(xiàn)，兩種溶劑配置的磺胺類抗生素標準溶液的SERS光譜探測均具有較好的效果，且氨水作為溶劑時效果更佳。但在用氨水對魚肉中磺胺類抗生素進行提取的過程中，發(fā)現(xiàn)溶液極易變渾濁，而用乙酸乙酯作為提取劑時得到的提取物溶液無色透明。圖3 為兩種提取劑的魚肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光譜圖。

圖中顯示，用乙酸乙酯作為提取劑時，磺胺甲基嘧啶增強效果好，探測靈敏度高，能夠檢測到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1處的主要特征峰，相對于固體拉曼光譜，其峰位有十個左右波數(shù)的偏移。用氨水作為提取劑時，受魚肉中大分子信號干擾大，對磺胺甲基嘧啶的探測效果差，信噪比低，僅能夠探測到磺胺甲基嘧啶在1 605 cm-1和734 cm-1處微弱的峰。究其原因，可能是因為氨水溶液與魚肉中的大分子蛋白質發(fā)生某些反應，導致溶液變渾濁，影響了磺胺甲基嘧啶的提取和增強吸附。因此，實驗中均選取乙酸乙酯作為定容溶劑和提取劑。

表1 兩種磺胺類抗生素主要拉曼峰歸屬[10]Tab.1 Raman bands of two kinds of sulfa antibiotics

圖3 兩種提取劑的魚肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光譜圖及銀溶膠溶液和純魚肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚肉, (c，d)為分別采用氨水、乙酸乙酯提取魚肉中磺胺甲基嘧啶；(e) 磺胺甲基嘧啶固體Fig.3 SERS Spectra of sulfamerazine in different solution extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) fish fresh, (c, d) sulfamerazine extracted from fish fresh in ammonia water and ethyl acetate respectively, (e) solid sulfamerazine

2.2.3 魚肉中磺胺類抗生素的檢測

以乙酸乙酯作為提取劑，按1.3.2中方法對魚肉中的不同濃度的磺胺類抗生素進行提取，提取液與銀溶膠1∶1混合，進行SERS光譜探測。圖4為磺胺甲基嘧啶固體拉曼光譜及魚肉中不同濃度的磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光譜。如前所述，相對于磺胺甲基嘧啶固體的拉曼光譜，提取液中能夠檢測到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342 cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1的主要特征峰。但相對于磺胺甲基嘧啶固體的拉曼峰大約有3～15個波數(shù)的頻移，可能是納米銀顆粒與吸附的磺胺甲基嘧啶發(fā)生電荷轉移，從而引起拉曼峰的漂移。當濃度為1 ppm時，在1 605 cm-1和1 102 cm-1處仍還存在微弱的磺胺甲基嘧啶的拉曼特征信號，因此可檢測到在魚肉中的濃度為1 ppm的磺胺甲基嘧啶。

圖4 魚肉中不同濃度磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光譜及銀溶膠溶液和純魚肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚肉提取液, (c, d, e)魚肉中不同濃度(1 ppm, 5 ppm 和50 ppm)磺胺甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺甲基嘧啶固體Fig.4 SERS Spectra of sulfamerazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamerazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish fresh, (f) solid sulfamerazine

圖5為魚肉中磺胺甲基嘧啶1 102 cm-1處的特征峰峰強與濃度之間的關系曲線?？梢钥闯觯鍙婋S濃度的升高而升高，在低濃度范圍內呈線性關系。經(jīng)LOD公式計算[11]，魚肉中磺胺甲基嘧啶的檢測限約為0.16 ppm。

圖5 魚肉中磺胺甲基嘧啶的特征峰強度與濃度變化關系曲線Fig.5 Dependence of peak intensity of sulfamerazine in fish on Concentration

圖6為磺胺二甲基嘧啶固體及魚肉中不同濃度的磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光譜。從圖中可知，對魚肉中的磺胺二甲基嘧啶進行提取后，探測到的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征峰相對較少，且在1 601 cm-1、1 024 cm-1、859 cm-1處出現(xiàn)了魚肉中大分子蛋白質的拉曼特征峰。在濃度不低于1 ppm時可以檢測到1 134 cm-1處的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征信號，因此可檢測到在魚肉中的濃度為1 ppm的磺胺二甲基嘧啶。

圖6 魚肉中不同濃度磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光譜及銀溶膠溶液和純魚肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚肉提取液, (c, d, e)魚肉中不同濃度(1 ppm, 5 ppm, 50 ppm)磺胺二甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺二甲基嘧啶固體Fig.6 SERS Spectra of sulfamethazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamethazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish, (f) solid sulfamethazine

圖7為魚肉中磺胺二甲基嘧啶在1 134 cm-1處的特征峰強度與濃度變化關系曲線，由圖中可以看出，在低濃度范圍內兩者呈線性關系，計算得出魚肉中磺胺二甲基嘧啶的檢測限為0.59 ppm。

圖7 魚肉中磺胺二甲基嘧啶的特征峰強度與濃度變化關系曲線Fig.7 Dependence of peak intensity of sulfamethazinein fish on Concentration

由2.2.1討論可知，磺胺甲基嘧啶相對磺胺二甲基嘧啶固體在1 564 cm-1、1 194 cm-1處出現(xiàn)了明顯的拉曼峰。對比圖4與圖6發(fā)現(xiàn)，魚肉中抗生素濃度為5 ppm時，磺胺甲基嘧啶相對磺胺二甲基嘧啶在1 551 cm-1、1 197 cm-1處依然有明顯的拉曼特征峰，可以據(jù)此差異區(qū)分低濃度時魚肉中的磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶的存在情況。

3 結論

本文通過分析磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶固體的分子結構和拉曼光譜，得出了兩者分子結構差異對拉曼特征信號的影響。通過對魚肉中磺胺類抗生素提取方法的研究，確定了最佳提取劑和定容溶劑。結果表明，以銀溶膠為基底，乙酸乙酯作為提取劑和定容溶劑，探測到魚肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低濃度均為1 ppm，檢測限分別為0.16 ppm和0.59 ppm，在低濃度范圍內特征峰強度與濃度呈線性關系。研究表明，SERS技術可以實現(xiàn)魚肉磺胺類抗生素的檢測，為實現(xiàn)水產(chǎn)品中抗生素的快速檢測提供了實驗基礎。

[1] 周筱青, 劉皈陽, 朱士俊. 醫(yī)院抗生素應用政策的制定、實施和成效[J]. 中國抗生素雜志, 2003, 28(4):204-211.

ZHOU Xiaoqing, LIU Guiyang, ZHU Shijun. The promulgation of hospital antibiotic policies and their practice, accomplishment[J]. Chinese Journal of Antibitics, 2003, 28(4):204-211.

[2] 劉小云, 舒為群. 水中抗生素污染現(xiàn)狀及檢測技術研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(8):1011-1014.

LIU Xiaoyun, SHU Weiqun. The advances of pollution and detection technology about antibiotics in water[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2005, 15(8):1011-1014.

[3] JEANMAIRED L, RICHARD P, VAN DUYNE. Surface raman spectroelectrochemistry:Part I. Heterocyclic, aromatic, and aliphatic amines adsorbed on the anodized silver electrode[J]. Electronal Chem, 1977, 84(1):1-20.

[4] KNEIPP K, HAKA A S, KNEIPP H K,etal. Surface-enhanced raman spectroscopy in single living cells using gold nanoparticles[J]. Appl Spectrosc, 2002, 56 (2):150-154.

[5] LLIESCU T, BAIAL M, PAVEL I. Raman and SERS investigations of potassium benzylpenicillin[J]. Raman Spectroscopy, 2006, 37(1-3):318-325.

[6] LI R, ZHANG H, CHEN Q W,etal. Improved surface-enhanced raman scattering on micro-scale Au hollow spheres:Synthesis and application in detecting tetracycline[J]. Analyst, 2011, 136(12):2527-2532.

[7] 李春穎, 賴克強, 張源圓, 等. 表面增強拉曼光譜檢測魚肉中禁用和限用藥物研究[J]. 化學學報, 2013, 71:221-226.

LI Chunying, LAI Keqiang, ZHANG Yuanyuan,etal. The study of banned and restricted drugs in fish based on surface-enhanced Raman spectroscopy technology[J]. Acta Chimica Sinica, 2013, 71:221-226.

[8] 馬君, 孔德地, 韓曉紅, 等. 應用銀溶膠膜探測水中抗生素的表面增強拉曼光譜研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2013, 33(10):2688-2693.

MA Jun, KONG Dedi, HAN Xiaohong,etal. Detection of antibiotics in water using silver colloids films as substrate of surface-enhanced Raman scattering[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2013, 33(10):2688-2693.

[9] LEE P C, MEISEAL D. Adsorption and SERS of dyes on silver and gold sols[J]. The Journal of Physical Chemistry, 1982, 86(17):3391-3395.

[10] DOLISH F R, FATELEY W G, BENTLEY F F, 等. 有機化合物的特征拉曼頻率[M]. 北京:中國化學會, 1980:210-212.

DOLISH F R, FATELEY W G, BENTLEY F F,etal. Raman frequencies of organic compounds[M]. Beijing:Chinese Chemical Society, 1980:210-212.

[11] YU L L, FASSETT J D, GUTHRIE W F. Detection limit of isotope dilution mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2002, 74(15):3887-3891.