張心敏，史曉鳳，韓曉紅，馬海寬，馬 君

(中國(guó)海洋大學(xué)光學(xué)光電子實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100)

0 引言

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技術(shù)作為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ墓庾V分析技術(shù)，逐漸成為表面科學(xué)和電化學(xué)領(lǐng)域有力的研究手段。因其靈敏度高、信息含量豐富、無(wú)需樣品預(yù)處理，且增強(qiáng)基底對(duì)生物體沒(méi)有損害等優(yōu)勢(shì)，使其在探測(cè)分析生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域扮演越來(lái)越重要的角色。而高靈敏度SERS活性基底的制備是獲得SERS信號(hào)的前提。金溶膠以其使用方便、易于制備、性能穩(wěn)定、靈敏度高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為SERS技術(shù)中最常用的增強(qiáng)基底之一[1]。

為了將SERS技術(shù)發(fā)展成一種常規(guī)、原位的痕量分析工具，提高活性基底的增強(qiáng)效果及其探測(cè)靈敏度尤為重要。在實(shí)際研究中，評(píng)價(jià)一個(gè)分析方法測(cè)試性能的重要指標(biāo)主要是增強(qiáng)因子和檢測(cè)限。其中，增強(qiáng)因子(Enhancement Factor, EF)用來(lái)描述SERS基底的活性，可以表征基底對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效果[2]；檢測(cè)限(Limit of Detection, LOD)則是評(píng)價(jià)一個(gè)分析方法、分析系統(tǒng)在低濃度范圍內(nèi)的檢測(cè)水平的高低[3]。

結(jié)晶紫分子(Crystal Violet, CV)常被作為探針?lè)肿?，用?lái)研究SERS基底的活性。它是一種酸堿指示劑，能夠較好的吸附在金溶膠顆粒上，產(chǎn)生較強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)[4]。Hidebrandt等[5]的研究表明CV的SERS光譜強(qiáng)度與其濃度或含量之間具有良好的線性關(guān)系；Liang等[6]通過(guò)向SERS體系中添加鹵素離子，實(shí)現(xiàn)了SERS增強(qiáng)因子的提高；首都師范大學(xué)的方炎小組[7]利用銀納米基底，研究了二十種氨基酸分子的結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子系列不同，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值獲得較好的探測(cè)靈敏度；馬君小組[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，金溶膠體系在pH值為13的堿性環(huán)境下對(duì)多環(huán)芳烴的探測(cè)效果最佳。

本文利用CV分子作為探針?lè)肿?，以金溶膠膜、自然狀態(tài)下(pH=6)以及通過(guò)改變體系的pH值達(dá)到最佳SERS增強(qiáng)效果時(shí)的金溶膠溶液(pH=13)為例，通過(guò)對(duì)比這三種活性基底的增強(qiáng)因子及其對(duì)CV溶液的檢測(cè)限，比較了金溶膠膜與金溶膠溶液增強(qiáng)效果的差異并分析了pH值對(duì)金溶膠溶液增強(qiáng)效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

氯金酸、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、鹽酸、濃硫酸、雙氧水、硝酸、結(jié)晶紫均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氨丙基三甲氧基硅烷、2-吡咯烷酮購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司，所有試劑和藥品均為分析純，使用時(shí)未進(jìn)一步提純。結(jié)晶紫溶液均使用去離子水配制為10-8～10-3mol/L的不同濃度。

1.2 儀器

電子天平( FA2104，上海精科天平)；超聲清洗器(KQ2200DB，昆山市超聲儀器公司)；磁力攪拌器(RCT basic，德國(guó)IKA公司)；移液器(QY-1000A，北京青云卓立精密設(shè)備有限公司)；恒溫干燥箱(DHG-9037A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550，日本島津公司)。

拉曼光譜探測(cè)系統(tǒng)如圖1所示，光譜儀為美國(guó)Ocean Optics公司的QE65000型拉曼光譜儀；光柵型號(hào)為H6，刻痕密度為1 200刻痕/mm，光譜分辨率為6 cm-1；光源采用的是785 nm近紅外連續(xù)半導(dǎo)體激光器，激光功率為80 mw；光纖探頭為美國(guó)InPhotonics公司的RIP-RPB-785型拉曼Y型光纖探頭。

圖1 拉曼探測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental set-up

1.3 金溶膠及金溶膠膜的制備

采用化學(xué)還原法制備金溶膠[9]，將30 mL濃度為2 mmol/L的氯金酸溶液加熱至沸騰，緩慢加入10 mL一定濃度的檸檬酸鈉溶液，在沸騰狀態(tài)下攪拌回流60 min后冷卻至室溫。所得金膠為磚紅色，經(jīng)測(cè)試其pH值為6。向金溶膠體系中添加適量氫氧化鈉，得到pH值為13的金溶膠溶液。

金溶膠膜的制備參考史曉鳳等改進(jìn)的自組裝法[10]。配制體積比為5%的三氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)甲醇溶液，將清洗過(guò)的石英片放入沸騰的APTMS甲醇溶液中進(jìn)行硅烷化3 h，使石英片表面附著氨基，有利于金屬納米顆粒的吸附。將石英片取出，清洗后交替浸入到已制備好的金溶膠中(1 h)和1 mmol/L的吡咯烷酮溶液中(0.5 h)，將上述浸泡過(guò)程重復(fù)5次，即可獲得對(duì)785 nm激發(fā)波長(zhǎng)增強(qiáng)效果最佳的金溶膠膜[11]。

2 結(jié)果與討論

光譜數(shù)據(jù)采用origin8.1軟件對(duì)SERS光譜進(jìn)行去基線處理。光譜探測(cè)時(shí)，每個(gè)樣品分別探測(cè)五次進(jìn)行平均，積分時(shí)間統(tǒng)一設(shè)為10 s。

2.1 金溶膠及金溶膠膜的表征

SERS活性基底的制備對(duì)于獲得SERS信號(hào)至關(guān)重要。采用化學(xué)還原法獲得的金溶膠，在正常情況下經(jīng)測(cè)試pH值為6，顏色為磚紅色，這是由于制備溶膠時(shí)檸檬酸鈉在加熱條件下生成的甲酸和乙酰乙酸未與氯金酸充分反應(yīng)造成的[12]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，直接利用此自然狀態(tài)下的金溶膠溶液作為活性基底的增強(qiáng)效果一般。通過(guò)加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)金溶膠體系的pH值可以改變金溶膠溶液中金納米顆粒的聚集程度，從而得到增強(qiáng)效果更佳的SERS活性基底[8]。隨著OH-離子在金溶膠溶液中濃度的升高，其顏色由磚紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)黑色。圖2(A)為 pH=6 和 pH=13 時(shí)的金溶膠溶液的消光光譜。分析此圖可知，在pH=6時(shí)，金溶膠溶液只有530 nm左右的一個(gè)等離子共振吸收峰，而當(dāng)pH=13時(shí)，消光光譜除530 nm的峰外又明顯出現(xiàn)了一個(gè)760 nm左右的等離子共振吸收峰。這可能是由于金納米顆粒發(fā)生聚集而產(chǎn)生的。圖2所示(B)和(C)為平均粒徑為57 nm的金溶膠溶液在pH=6和pH=13時(shí)的掃描電鏡圖，可以看出金溶膠溶液在pH值為6的狀態(tài)下金納米顆粒只有少數(shù)聚合；而當(dāng)pH值為13時(shí)，金納米顆粒出現(xiàn)顯著的聚合現(xiàn)象。

圖2 不同pH值金溶膠溶液的消光光譜(A)和SEM圖像(B:pH=6; C:pH=13)Fig.2 Extinction spectra (A) and SEM images (B and C) obtained from the gold colloid solutions with different pH values of pH=6 and pH=13

采用自組裝法制備金溶膠膜，通過(guò)控制APTMS甲醇溶液的溫度，控制吸附到石英片上APTMS的量，從而控制自組裝到石英片表面上金納米顆粒的個(gè)數(shù)，進(jìn)而控制金溶膠膜等離子共振吸收峰的位置。得到靈敏度高、重復(fù)性好的SERS活性基底。圖3所示為金溶膠膜的消光光譜和SEM圖。相對(duì)于金溶膠的單分散性，納米顆粒在石英片上的自組裝以及顆粒之間的相互作用大大促進(jìn)了金納米顆粒的聚集程度。從圖中可以看出，該金溶膠膜的平均粒徑為62 nm，除了具有金溶膠530 nm處的等離子共振吸收峰外，在與激發(fā)波長(zhǎng)(即785 nm)相近處也出現(xiàn)了明顯的吸收峰。

圖3 金溶膠膜的消光光譜(A)和金溶膠膜的SEM圖像(B)Fig.3 Extinction spectra(A) and SEM image (B) obtained from the gold colloid film

2.2 結(jié)晶紫SERS光譜探測(cè)及增強(qiáng)因子的計(jì)算

圖4為5×10-7mol/L CV溶液分別以金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠溶液為活性基底的SERS光譜與10-3mol/L CV溶液的普通拉曼光譜的比較。圖中，CV溶液的拉曼光譜、以金溶膠膜和pH值為6的CV溶液為活性基底的SERS光譜分別放大了10倍、5倍和2倍。圖中標(biāo)示出的CV的部分特征峰分別為：419 cm-1處的C-苯彎曲振動(dòng)，722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1的C-H彎曲振動(dòng)，907 cm-1、941 cm-1處的環(huán)骨架振動(dòng)，1 297 cm-1的苯環(huán)內(nèi)C-C伸縮振動(dòng)以及1 579 cm-1處的苯環(huán)內(nèi)C-C伸縮、彎曲振動(dòng)[13]。與CV溶液的普通拉曼光譜相比，以金溶膠為活性基底時(shí)，CV溶液的拉曼峰位有1～8 cm-1的頻移，說(shuō)明CV分子與金納米顆粒之間發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用，并且CV分子中的N具有孤對(duì)電子、苯環(huán)上具有π電子，這些都使得CV分子很容易與金納米表面發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移[14]。

圖4 三種不同基底的CV溶液(5×10-7 mol/L)SERS光譜(b, c, d)及較高濃度(10-3 mol/L)的CV溶液的拉曼光譜(a)比較. 所采用的基底分別為金溶膠膜(b)、pH=6金溶膠溶液(c)及pH=13金溶膠溶液(d)Fig.4 The SERS spectra of CV solution (5×10-7 mol/L) obtained with three different substrates of gold colloid film(b), gold colloid solution at pH=6 (c) and gold colloid solution at pH=13 (d). Spectrum (a) taken from CV solution ( 10-3 mol/L ) with conventional Raman setup as a comparison

以CV為探針?lè)肿?，SERS活性基底的增強(qiáng)因子(EF)可通過(guò)下式計(jì)算[2]：

(1)

式中ISERS為CV分子的SERS信號(hào)強(qiáng)度，IRS為普通拉曼的信號(hào)強(qiáng)度，Nsurf和Nvol分別為SERS體系下和普通拉曼體系下有效散射體積內(nèi)CV的平均分子數(shù)。

當(dāng)以面積為S=0.6 cm×0.8 cm的金溶膠膜為SERS活性基底時(shí)，增強(qiáng)因子計(jì)算公式可進(jìn)一步表示為:

(2)

式中Cvol=10-3mol/L和Csurf=5×10-7mol/L分別是普通拉曼探測(cè)和SERS探測(cè)時(shí)CV溶液的濃度，h=0.23 cm為有效散射深度，Vsurf=50 μL是滴加在金溶膠膜上的的CV溶液的體積。根據(jù)文獻(xiàn)，CV分子在粗糙表面的吸附率大約為10%[15,16]。

對(duì)于金溶膠溶液活性基底，SERS探測(cè)和拉曼探測(cè)時(shí)的有效散射體積近似相同，此時(shí)SERS增強(qiáng)因子的計(jì)算公式可以表示為：

(3)

以金溶膠膜以及pH=6和pH=13的金溶膠溶液為活性基底，選取CV位于722cm-1、801 cm-1、1172 cm-1處三個(gè)特征峰為例計(jì)算了其增強(qiáng)因子，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，與金溶膠膜相比，金溶膠溶液作為基底時(shí)的增強(qiáng)因子更高。這是因?yàn)榻鹑苣z體系是處于三維空間內(nèi)，而金溶膠膜體系只是處于二維平面內(nèi)，導(dǎo)致CV分子在相同有效散射面積內(nèi)，在金溶膠溶液表面的吸附數(shù)量要遠(yuǎn)大于金溶膠膜表面。所以金溶膠溶液的增強(qiáng)效果要優(yōu)于金溶膠膜。對(duì)比兩種不同pH環(huán)境下金溶膠溶液的增強(qiáng)因子可知，pH=13時(shí)金溶膠溶液的增強(qiáng)效果有極大的提高，在1 172 cm-1處，其增強(qiáng)因子達(dá)到2.3×107。這可能是由于OH-的加入促進(jìn)了金納米顆粒的聚合，導(dǎo)致pH=13的金溶膠溶液相對(duì)于pH=6的金溶膠溶液出現(xiàn)了一個(gè)與激發(fā)波長(zhǎng)相近的等離子共振吸收峰(如圖2A)，使拉曼躍遷的幾率大大增加，同時(shí)聚合的金納米顆粒增強(qiáng)了粒子間的耦合從而增加了局域電磁場(chǎng)的強(qiáng)度，并且OH-的加入能夠增加金屬表面的活位數(shù)量從而增加與表面吸附的CV分子數(shù)量，使得SERS信號(hào)能夠進(jìn)一步增強(qiáng)[6, 17]。

2.3 結(jié)晶紫檢測(cè)限的計(jì)算

為進(jìn)一步比較金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠溶液的探測(cè)靈敏度，本文計(jì)算了以這三種金溶膠為活性基底時(shí)CV溶液的檢測(cè)限。圖5及圖6分別是以金溶膠膜為活性基底時(shí)不同濃度CV的SERS光譜以及CV溶液722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1處特征峰的拉曼峰強(qiáng)與濃度之間的關(guān)系。以pH=6以及pH=13的金溶膠溶液為SERS基底時(shí)CV溶液位于722 cm-1、801 cm-1、1 172 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)與濃度之間的關(guān)系如圖7及圖8所示，圖中的誤差條均為標(biāo)準(zhǔn)偏差。從中可以看出，以金溶膠膜為活性基底時(shí)，對(duì)同一樣品多次探測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯大于以金溶膠溶液為基底時(shí)。這表明，采用金溶膠溶液為活性基底更有利于樣品的定量分析。

根據(jù)檢測(cè)限的計(jì)算公式：

(4)

式中σ為多次測(cè)得空白響應(yīng)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為CV定標(biāo)曲線的斜率。經(jīng)上述公式計(jì)算，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，CV溶液在金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠SERS基底上的檢測(cè)限分別能夠達(dá)到70.7 nmol/L、9.6 nmol/L和1.8 nmol/L。充分表明，調(diào)節(jié)金溶膠溶液的pH值，可以有效的提高基底的SERS增強(qiáng)效果，降低其對(duì)CV溶液的檢測(cè)限。

圖5 不同濃度CV溶液在金溶膠膜上的SERS光譜. (a) 500 nmol/L, (b) 700 nmol/L, (c) 800 nmol/L, (d) 900 nmol/L, (e) 1 000 nmol/LFig.5 The SERS spectra obtained from CV solution of different concentrations of 500 nmol/L(a), 700 nmol/L (b), 800 nmol/L (c), 900 nmol/L(d) and 1 000 nmol/L (e) with the substrate of gold colloid film

圖6 金溶膠膜為SERS基底時(shí)CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172cm-1拉曼頻移處的定標(biāo)曲線Fig.6 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1, 801 cm-1 and 1 172cm-1 with the substrate of gold colloid film

圖7 pH=6的金溶膠溶液為SERS基底時(shí)CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172 cm-1拉曼頻移處的定標(biāo)曲線Fig.7 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1，801 cm-1 and 1 172 cm-1 with the substrate of gold colloid solution(pH=6)

圖8 pH=13的金溶膠溶液為SERS基底時(shí)CV在722 cm-1、801 cm-1和1 172 cm-1拉曼頻移處的定標(biāo)曲線Fig.8 Calibration curve for CV at Raman shifts of 722 cm-1，801 cm-1 and 1 172 cm-1 with the substrate of gold colloid solution(pH=13)

由表2可知，CV溶液在金溶膠膜、pH=6及pH=13的金溶膠SERS基底上的檢測(cè)限分別能夠達(dá)到70.7 nmol/L、9.6 nmol/L和1.8 nmol/L。充分表明，調(diào)節(jié)金溶膠溶液的pH值，可以有效的提高基底的SERS增強(qiáng)效果，降低其對(duì)CV溶液的檢測(cè)限。

3 結(jié)論

通過(guò)計(jì)算CV溶液在金溶膠膜、pH=6和pH=13的金溶膠溶液表面的SERS增強(qiáng)因子以及在這三種金溶膠基底上CV溶液的檢測(cè)限，分析了這三種SERS基底的增強(qiáng)效果。計(jì)算結(jié)果表明，在785 nm近紅外激發(fā)條件下，這三種活性基底都能得到較好的SERS增強(qiáng)，尤其是pH=13時(shí)的金溶膠溶液，能達(dá)到高于金溶膠膜及pH=6的金溶膠溶液103和102倍的增強(qiáng)。利用這三種金溶膠基底對(duì)CV進(jìn)行SERS探測(cè)，可以得到CV的檢測(cè)限分別為70.7 nmol/L、9.6 nmol/L 和1.8 nmol/L。說(shuō)明，金溶膠溶液的增強(qiáng)效果要明顯優(yōu)于金溶膠膜，而調(diào)節(jié)金溶膠體系的pH值能夠達(dá)到使其探測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高的目的。因此，調(diào)節(jié)pH的金溶膠體系是一種在生物醫(yī)學(xué)乃至臨床醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊應(yīng)用前景的SERS活性基底。

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