梁媛媛，張海利，楊魯萍，焦艷華

(1.杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310036；2.杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311121；3.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

基于金屬鰲合親和介質(zhì)的六聚組氨酸融合蛋白純化方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，國外公司已經(jīng)推出了各種用于純化六聚組氨酸融合蛋白的產(chǎn)品，但是售價昂貴，國內(nèi)相應(yīng)產(chǎn)品較為短缺[1-2].本文擬以自制的磁性瓊脂糖凝膠微球為載體，亞氨基乙二胺為鰲合劑制備表面螯合Ni2+的金屬鰲合親和磁性微球，用于六聚組氨酸融合蛋白的純化，并與商品化鎳鰲合次氨基三乙酸瓊脂糖微球(NTA-Ni)的性能進行比較.本研究的開展為了尋求價廉物美的新型蛋白純化試劑以代替價格昂貴的進口產(chǎn)品，具有重要的現(xiàn)實意義.

1 實驗部分

1.1 試劑

氯化鐵、氯化亞鐵、HCl、NaOH、Tween-20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4等均為天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品(分析純)；瓊脂糖、1,4-二氧六環(huán)、環(huán)氧氯丙烷、亞氨基乙二酸、氯化鎳、咪唑等均為阿拉丁試劑公司產(chǎn)品(分析純)；NTA-Ni為Qiagen公司產(chǎn)品；六聚組氨酸融合蛋白K8粗菌液由杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心李海峰博士惠贈.

1.2 Fe3O4納米粒子的制備

稱取3.4 g FeCl3·6H2O與1.2 g FeCl2·4H2O溶于800 mL水中，氮氣保護下機械攪拌(300 r/min)，水浴加熱至60 ℃，滴加40 mL 1.5 mol/L NaOH溶液，反應(yīng)液由黃色變?yōu)楹谏?，滴加完畢后繼續(xù)攪拌2 h，再升溫至90 ℃，攪拌2 h后停止反應(yīng)，磁分離合成好的Fe3O4，并用純水洗滌至pH呈中性，凍干保存?zhèn)溆?

1.3 磁性瓊脂糖微球(Mag-Agarose)的制備及活化

稱取上述制備的0.6 g Fe3O4投于50 mL水中，均勻分散，再加入3.0 g瓊脂糖，搖勻，再微波爐中加熱至完全溶解，120 ℃下加入甲苯(140 mL)、四氯化碳(60 mL)和Span 80(10 mL)的混合溶液中，1000 r/min攪拌，冷卻至室溫.用分液漏斗除去反應(yīng)液中的油相，然后用磁分離方法除去反應(yīng)液，最后用乙醇和純水洗滌多次，然后采用布氏漏斗抽濾除去液相；稱取10 g 上述固相產(chǎn)品，投于10 mL純水之中，攪拌分散均勻，加入1 mL環(huán)氧氯丙烷，25 ℃水浴加熱30 min，滴加6 mL 5 mol/L的 NaOH溶液，繼續(xù)攪拌60 min，再升溫至60 ℃反應(yīng)90 min，停止反應(yīng)后采用布氏漏斗抽濾除去反應(yīng)液，水洗Mag-Agarose至pH中性，備用.

1.4 Mag-Agarose的環(huán)氧化

將上一步得到的產(chǎn)品投入6.5 mL 2 mol/L的NaOH溶液之中，并加入4 mL環(huán)氧氯丙烷和15 mL 50%的1,4-二氧六環(huán)，于45 ℃恒溫?fù)u床中振蕩反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用布氏漏斗抽濾除去，固相產(chǎn)品水洗至pH中性，獲得表面含有環(huán)氧基團的磁性瓊脂糖凝膠微球Mag-Agarose-Epo.

1.5 環(huán)氧化Mag-Agarose的羧酸化

將4 g亞氨基乙二酸在冰浴下投入25 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液中，攪拌至完全溶解，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.5，再將上一步制好的環(huán)氧化磁性凝膠微球投入上述配好的溶液之中，25 ℃水浴下反應(yīng)過夜.反應(yīng)液用布氏漏斗抽濾除去，水洗Mag-Agarose至pH中性，獲得表面含有羧酸基團的磁性瓊脂糖凝膠微球Mag-Agarose-Aci.

1.6 羧酸化Mag-Agarose的鎳化

將上一步反應(yīng)得到的羧酸化磁性瓊脂糖微球投入100 mL 0.5 mol/L的氯化鎳溶液之中，25 ℃水浴下攪拌48 h，停止反應(yīng).反應(yīng)液用布氏漏斗抽濾，水洗除去殘留的氯化鎳，最后得到表面含有Ni2+的螯合磁性微球Mag-Agarose-Ni，置于100 mL 30%乙醇溶液中保存?zhèn)溆?

1.7 六聚組氨酸融合蛋白親和層析純化

在0.7 g Mag-Agarose-Ni中加入1 mL K8酶粗菌液，4 ℃振蕩孵育1 h，磁分離，加入2 mL 裂解緩沖液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 咪唑, 1% Tween 20,pH 8.0)，振蕩15 min，磁分離，再用2 mL 清洗液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 咪唑, 0.05% Tween 20,pH 8.0)清洗，振蕩15 min，磁分離，收集未被吸附的物質(zhì)W液，最后用2 mL洗脫液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 咪唑, 0.05% Tween 20, pH 8.0)洗脫4次，磁分離，收集洗脫液E液，并將上述收集到的W液、E液進行SDS-PGMA電泳分析.

純化容量：取2 mg Mag-Agarose-Ni于離心管中，加入融合蛋白K8的菌體裂解液2 mL孵育15 min，磁性分離，測定上清中蛋白濃度，至上清液中蛋白濃度不再升高磁粒達到飽和為止.用清洗緩沖液洗去未吸附的雜蛋白后采用咪唑洗脫吸附的融合蛋白，通過Bradford法測定洗脫的蛋白含量，并按式(1)對Mag-Agarose-Ni的純化容量進行計算.

純化容量(μg/mg)=洗脫液中蛋白含量(μg)/凝膠微球重量(mg)

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 Mag-Agarose-Ni的結(jié)構(gòu)與表征

圖1 Mag-Agarose-Ni的制備示意圖

圖2 磁性瓊脂糖凝膠微球(a)、環(huán)氧化磁性瓊脂糖微球(b)、羧酸化磁性瓊脂糖微球(c)以及鎳化磁性瓊脂糖微球(d)的紅外光譜圖

表面含有Ni2+的螯合磁性微球Mag-Agarose-Ni的制備過程如圖1所示，我們采用紅外光譜對各反應(yīng)步驟中的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了表征，結(jié)果如圖2所示.從圖2b中可以看出，經(jīng)過環(huán)氧化處理后，瓊脂糖凝膠微球在911、847 cm-1處出現(xiàn)了環(huán)氧基團特振吸收峰，進一步經(jīng)過羧酸化處理后，在圖2c中的1 740 cm-1處出現(xiàn)了羰基振動吸收峰，表明瓊脂糖凝膠經(jīng)過羧酸化處理后，表面成功引入了羧酸基團；圖2d為螯合了金屬鎳離子的瓊脂糖凝膠紅外光譜，從圖中可以看出，由于羧酸基團通過吸附配位作用與金屬鎳離子作用，碳氧鍵上的π電子發(fā)生離域，故該處羰基的吸收振動峰消失，證實了鎳離子已經(jīng)成功地螯合在了磁性瓊脂糖凝膠微球的表面.進一步通過原子吸收光譜測試測定了Mag-Agarose-Ni表面螯合的Ni2+的量為2.12×10-5mol/mg.

金屬鰲合親和層析介質(zhì)形貌以及表面粗糙程度直接影響介質(zhì)的非特異性吸附的大小.介質(zhì)表面越光滑，非特異性吸附越弱，分離效果就越好.圖3為磁性瓊脂糖磁性微球螯合Ni2+前后的SEM照片.從圖中可以看出，磁性瓊脂糖微球在螯合Ni2+后，其形貌上沒有發(fā)生明顯變化，說明在本實驗條件下，磁性瓊脂糖微球能很好地保持其原有形貌特征，微球表面依然比較光滑，可減小非特異的吸附[3].

圖3 磁性瓊脂糖凝膠微球螯合Ni2+前后的SEM照片

圖4是Mag-Agarose-Ni在溫度為300 K時的磁滯回線.從圖中可以看出，外磁場從-10 KOe到10 KOe的循環(huán)掃描中，Mag-Agarose-Ni 磁滯回線重合為一條曲線，說明Mag-Agarose-Ni具有超順磁性[4]，Mag-Agarose-Ni飽和磁化強度為20.8 emu/g，具有良好的磁響應(yīng)性.

圖4 Mag-Agarose-Ni的磁滯回線(300 K)

泳道1：分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白;泳道2：洗脫液；泳道3：未被吸附物質(zhì).

2.2 用于六聚組氨酸融合蛋白親和純化

泳道1：分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2：經(jīng)Mag-Agarose-Ni純化處理后的洗脫液；泳道3：經(jīng)Ni-NTA 純化處理后的洗脫液.

用 Mag-Agarose-Ni對K8融合蛋白進行純化，將得到的樣品進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示.從圖5中2、3泳道對比可以看出，經(jīng)過Mag-Agarose-Ni吸附處理后，幾乎所有的靶蛋白都結(jié)合在了Mag-Agarose-Ni上，經(jīng)吸附后的殘液中幾乎沒有靶蛋白條帶出現(xiàn)，說明合成的Mag-Agarose-Ni對K8的親和性好，非特異性吸附很小，經(jīng)高濃度的競爭吸附劑咪唑洗脫后，得到了單一的K8融合蛋白條帶，條帶清晰，說明Mag-Agarose-Ni 對六聚組氨酸融合蛋白具有很好的分離效果.

圖6是Mag-Agarose-Ni與市售的NTA-Ni對蛋白溶液的SDS-PAGE分析.從圖中2、3泳道的對比可以看出，經(jīng)Mag-Agarose-Ni純化得到的洗脫液中，K8蛋白條帶清晰，且其他蛋白條帶不明顯，而經(jīng)Ni-NTA純化得到的洗脫液中，盡管出現(xiàn)了目標(biāo)蛋白K8的條帶，但其他雜蛋白條帶依然存在，進一步通過Bradford法對K8的純化量進行了測試，Mag-Agarose-Ni和Ni-NTA對K8的吸附容量分別為8.8 μg/mg 和5.2 μg/mg.以上結(jié)果說明Mag-Agarose-Ni對六聚組氨酸蛋白K8有良好的純化效果，選擇性和純化容量均優(yōu)于市售的Ni-NTA，且可通過磁分離技術(shù)進行洗脫操作，簡化了純化步驟，適用于蛋白的大規(guī)模純化.

3 結(jié) 論

1) 以自制磁性瓊脂糖微球為基質(zhì)，環(huán)氧氯丙烷為活化劑，亞氨基乙二酸作為螯合劑，制備了表面螯合Ni2+的磁性凝膠微球(Mag-Agarose-Ni).IR結(jié)果表明Ni2+成功螯合到了磁性凝瓊脂糖膠微球上；SEM結(jié)果顯示在螯合Ni2+后，Mag-Agarose-Ni形貌沒有發(fā)生明顯變化，且平均粒徑為23 μm；原子吸收光譜顯示Mag-Agarose-Ni表面螯合的Ni2+的量為2.12×10-5mol/mg；磁性能測試表明Mag-Agarose-Ni具有超順磁性，其磁飽和強度為20.8 emu/g，具有良好的磁響應(yīng)性.

2) 將Mag-Agarose-Ni用于六聚組氨酸融合蛋白K8的純化研究，SDS-PAGE結(jié)果表明Mag-Agarose-Ni對K8有很好的親和作用，分離效果好，經(jīng)15 min的孵育后，Mag-Agarose-Ni對K8的吸附容量可達到8.8 μg/mg.

[1]Porath J, Carlsson J, Olsson I,etal. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation[J]. Nature,1975,258(5536):598-599.

[2]Hochuli E, Dobeli H, Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighboring histidine residues[J]. Journal of Chromatography A,1987,411:177-184.

[3]Ji Z, Pinon D I, Miller L J. Development of magnetic beads for rapid and efficient metal-chelate affinity purifications[J]. Journal of Chromatography A,1998,795(2):211-217.

[4]Saravanan P, Alam S, Mathur G. Comparative study on the synthesis of γ-Fe2O3and Fe3O4nanocrystals using high-temperature solution-phase technique[J]. Journal of Materials Science Letters，2003,22(18):1283-1285.