，， ，,2

(1.浙江工業(yè)大學 藥學院,浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學 綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地,浙江 杭州 310014)

眾所周知，血清蛋白是一種最豐富的載體蛋白，對許多藥物和代謝物具有較強的親和力.通常，血清蛋白與藥物間相互作用越強，血液中游離藥物濃度越低；而弱相互作用導致藥物在體內分布較差.因而，血清蛋白在藥物的傳輸、分布和代謝過程中起著重要作用[1].研究藥物與血清蛋白相互作用對理解藥物作用機制和代謝過程、改造藥物結構和開發(fā)新藥是十分有用的[2-3]，已成為生命科學、化學和醫(yī)學領域研究熱點之一.牛血清蛋白(BSA)是由583個氨基酸殘基構成三個結構域，每個結構域都由兩個亞結構域(A和B)構成.它與人血清蛋白(HSA)有著極為相似的結構序，因此BSA已廣泛用于小分子化合物與血清蛋白相互作用的研究[4-9].

洛伐他汀(Lovastain)是一種3-羥基-3-甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑[10-11]，主要用于血脂異常的治療和心血管疾病的預防，也具有誘導卵巢癌細胞凋亡[12]和降低乳腺癌細胞的生長[13]的潛力.至今，有關洛伐他汀與血清蛋白相互作用的研究國內外尚未見公開報道，開展血清蛋白與洛伐他汀相互作用研究，對進一步闡述其藥代和藥理作用具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

F96S熒光儀(上海棱光技術有限公司);J-815圓二色譜儀(日本JASCO公司)；UV-1601紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；雷磁pHS-25型數顯pH計(上海精密科學儀器有限公司).Chem3D (Version 8.0)軟件(美國CambridgeSoft公司)；Gaussian 03軟件(美國Gaussian公司)；AutoDock 4.0軟件來自于SWISS-MODEL Repository (http://swissmodel.expasy.org/repository/?pid=smr01&zid=async).

洛伐他汀(≥99.9%)由杭州默沙東公司(杭州,中國)提供；BSA購于上海申航生物科技有限公司(上海,中國)；保泰松(≥99.9%)購于湖北恒碩化工有限公司(湖北,中國)；布洛芬(≥99.9%)由浙江工業(yè)大學藥學院提供.三(羥基甲基)氨基甲烷(≥99%)購于衢化試劑有限公司(浙江,中國).

其他所用試劑均為分析純，整個實驗所用水為二次重蒸水.

1.2 溶液配制

洛伐他汀溶液：準確稱量0.101 1 g洛伐他汀用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后準確移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲備液.此溶液保存溫度4 ℃以下.

BSA溶液：稱取0.730 5 g氯化鈉和0.166 1 g牛血清蛋白，置于250 mL容量瓶中，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成10-5mol/L BSA-NaCl儲備液.此溶液保存于4 ℃以下.

保泰松溶液：準確稱量0.077 1 g保泰松用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后準確移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲備液.

布洛芬溶液：準確稱量0.051 6 g布洛芬用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后精密移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲備液.

1.3 熒光光譜測定

配制一系列含有不同洛伐他汀濃度的BSA溶液，含BSA濃度為1.0×10-6mol/L，設定激發(fā)波長為289 nm，在不同溫度下測定其熒光光譜，掃描范圍300～450 nm.測定時，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液進行熒光空白校正.

1.4 紫外光譜測定

在室溫下，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測定BSA和洛伐他汀溶液的紫外光譜，掃描范圍200～400 nm.

1.5 圓二色譜測定

在室溫下，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測定BSA和洛伐他汀溶液的圓二色譜，掃描范圍200～240 nm.

1.6 分子對接模擬

BSA晶體結構數據(P02769)從Protein Data Bank (http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)獲取.洛伐他汀3D結構數據從PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取，其結構運用DFT理論在B3lyp/6-311+G(d)水平上進行最低能量優(yōu)化至Hessian矩陣分析無虛頻，其理論計算在Gaussian 03軟件上完成.

洛伐他汀與BSA之間的相互作用運用AutoDock 4.0軟件模擬.模擬計算時，網格大小設置為60(60(60，網格中心分別設置為(6.113 4,-11.009 6,7.119 7),points(6.841 1,2.435 6,-14.718 4) and points (-1.216,-20.239,-6.738).采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian GA)，進行200次運算，其他參數均設置為程序的默認值.

2 結果與討論

2.1 BSA熒光猝滅

蛋白質具有天然熒光，這種吸收主要是來自與蛋白分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基.含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的蛋白質，最大熒光發(fā)射約在320～350 nm范圍內.三種氨基酸中，色氨酸的熒光強度最強，對微環(huán)境的變化最為敏感，所以研究溶液中蛋白質的構象變化時，常將其作為蛋白質的內源熒光探針[14-15].從圖1可知：隨著洛伐他汀濃度的增加，BSA的熒光強度逐漸降低；而最大發(fā)射波長未發(fā)生變化.這表明了洛伐他汀與BSA發(fā)生了相互作用，從而導致BSA熒光猝滅.其猝滅常數可用Stern-Volmer方程計算[16],即

(1)

式中：F0為無猝滅劑洛伐他汀存在時BSA溶液的熒光發(fā)射強度；F為猝滅劑洛伐他汀存在時BSA溶液的熒光發(fā)射強度；[Q]為猝滅劑洛伐他汀總濃度；kq為生物分子猝滅速率常數；KSV為猝滅速率常數；τ0≈6ns[17]為無猝滅劑存在時BSA的平均熒光壽命.

從曲線0—5，CLovastatin=0,5×10-6,10×10-6, 15×10-6,20×10-6和25×10-6 mol/L

從圖2可見：F0/F與洛伐他汀濃度之間具有良好的線性關系，由其斜率可求得不同溫度下的猝滅常數(KSV).一般認為，對由于形成基態(tài)結合物的靜態(tài)猝滅，其KSV隨溫度升高而減?。欢蓴U散碰撞引起的動態(tài)猝滅，KSV隨溫度升高而增大.另外，動態(tài)猝滅過程中，其猝滅速率常數(kq)小于2×1010L/(mol·s)[18].從表1可知：洛伐他汀誘導的BSA熒光猝滅常數隨溫度升高而減小，并且猝滅速率常數(kq)大于2×1010L/(mol·s).這表明了洛伐他汀誘導的BSA熒光猝滅是一個靜態(tài)猝滅過程，則洛伐他汀與BSA相互作用形成了結合物.

圖2 不同溫度下洛伐他汀猝滅BSA的Sterm-Volmer圖

表1 不同溫度下洛伐他汀猝滅BSA的猝滅常數

2.2 結合常數和結合位點的測定

對于靜態(tài)猝滅，假設蛋白分子對配體分子有n個等同且獨立的結合部位，其可結合常數(Kb)和結合位點數(n)可根據方程計算[16]，即

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(2)

因此，從圖3的線性回歸方程可得洛伐他汀與BSA的結合常數(Kb)和結合位點數(n)，其結果如表3所示.從表3可知:在實驗溫度范圍內，BSA與洛伐他汀的結合位點數(n)接近1，表明了洛伐他汀與BSA相互作用形成1∶1結合物，且結合常數為7.11×103L/mol (298 K).

圖3 不同溫度下洛伐他汀對BSA熒光猝滅的雙對數曲線

表2 洛伐他汀結合到BSA上的熱力學參數和結合常數(Kb)

2.3 熱力學參數和結合模式

配體與蛋白相互作用過程中的主要非共價作用力有：氫鍵、范德華力、疏水作用及靜電作用四種.配體與蛋白相互作用過程中的熱力學參數的大小和正負，常用于判斷配體與蛋白的作用模式.一般認為，ΔH0>0和ΔS0>0時，為典型的疏水作用；ΔH0<0和ΔS0<0時，分子間作用力為氫鍵作用和范德華力；ΔH0<0和ΔS0>0時，同時存在疏水作用和氫鍵作用；ΔH0≈0或較小、ΔS0>0時，主要作用力為靜電作用[19].當溫度變化不大時，蛋白與藥物結合過程中的焓變(ΔH0)、熵變(ΔS0)及吉布斯自由能(ΔG0)可由Van’t Hoff方程測定[8]，即

ΔG0=-RTlnKb

(3)

(4)

式中R為氣體常數.結果表明：lnKb與1/T之間具有良好線性關系，其熱力學參數計算結果列于表2.BSA與洛伐他汀作用過程中的ΔH0和ΔS0分別為-18.126 kJ/mol和12.84 J/(mol·K)(表2)，表明了BSA與洛伐他汀相互作用的主要作用力是疏水作用和氫鍵作用.

2.4 圓二色譜和紫外光譜的測定

圓二色譜(CD)是一種常用于鑒定蛋白與配體相互作用過程中蛋白的二級結構變化的方法.當洛伐他汀存在時BSA的CD譜如圖4所示.從圖4可知：游離BSA溶液存在兩個負吸收帶，分別位于209 nm和222 nm.這是BSA二級結構的特征峰，它歸屬于α-螺旋肽鍵的π→π*和n→π* 電子躍遷.當洛伐他汀加入到BSA溶液后，BSA的CD譜的負峰強度略有增強.這表明了洛伐他汀與BSA結合后，導致BSA的二級結構變化，且其α-螺旋量略有增加.

1-游離BSA溶液(1.0×106 mol/L);2-游離洛伐他汀溶液(25×106 mol/L);3-洛伐他汀(25×106 mol/L)和BSA(1.0×106 mol/L)混合溶液;4-曲線3與曲線2的差譜

從圖5可知：洛伐他汀和BSA混合溶液與游離洛伐他汀的差譜與游離BSA光譜存在著一定變化，其吸光度略有增加，并且其吸收波長紅移.這意味著BSA二級結構發(fā)生了微小變化.

1-游離洛伐他汀(25×106 mol/L);2-游離BSA溶液(0.5×106 mol/L);3-洛伐他汀(25×106 mol/L)和BSA(0.5×106 mol/L)混合溶液;4-曲線3與曲線1的差譜

2.5 結合位點的確定

許多研究結果表明配體在BSA上的結合位點主要有亞結構域IIA(site I)和亞結構域IIIA(site II)位，而且保泰松、華法林結合在site I位上，布洛芬、氯滅酸結合在site II位[20].為了測定洛伐他汀在BSA上結合位點，保泰松和布洛芬分別用作site I和site II位的探針分子.在結合位點探針分子存在下，BSA(CBSA=1×10-6mol/L)溶液的熒光光譜如圖6所示.從圖6可知：隨著洛伐他汀加入到保泰松-BSA混合液中，BSA的熒光強度隨之下降，出現熒光猝滅；而洛伐他汀加入布洛芬-BSA混合液中，其BSA的熒光強度基本不變.依據式(2)可計算出位點探針分子存在下，BSA與洛伐他汀的結合常數，如表3所示.從表3可見：當保泰松位點探針分子存在時，BSA與洛伐他汀的結合常數變化較??；而布洛芬位點探針分子存在時，BSA與洛伐他汀的結合常數接近0.這表明了布洛芬與洛伐他汀與BSA之間發(fā)生了明顯競爭結合，意味著洛伐他汀主要結合在BSA的site II上.

曲線0—5洛伐他汀濃度：0,5×10-6,10×10-6,15×10-6,20×10-6,25×10-6 mol/L

表3 在位點探針分子存在下BSA與洛伐他汀的結合常數

2.6 分子對接

為了進一步闡明洛伐他汀與BSA的結合位點和相互作用力，依據保泰松和布洛芬在HSA上的結合位點，用AutoDock 4.0進行模擬洛伐他汀與BSA的相互作用，其結果列于表4.結合能越小，表明形成的結合物越穩(wěn)定.因此，洛伐他汀優(yōu)先結合在BSA的site II位上，如圖7(a)所示.這與探針分子競爭實驗結果是一致的.從圖7(b)可知：洛伐他汀-BSA結合物中，距洛伐他汀5.000范圍內氨基酸殘基有疏水性殘基(Ala-314,Leu-221,Leu-261,Leu-478,Pro-470)、極性殘基(Cys-471,Trp-237,Tyr-475,)和帶電荷殘基(Arg-218,Arg-222,Arg-241,Asp-474,Lys-245).另外，洛伐他汀與Arg-218和Arg-241殘基間形成穩(wěn)定氫鍵(圖7c)，并且ΔE3絕對值明顯小于ΔE2.這表明了洛伐他汀與BSA間的主要作用力是疏水作用力和氫鍵作用力，這與熱力學參數分析結果是一致的.

表4 分子對接獲到的洛伐他汀-BSA結合物的能量1)

圖7 洛伐他汀與BSA分子對接結果圖

3 結 論

實驗結果表明：洛伐他汀通過疏水作用和氫鍵作用插入BSA的亞結構域IIIA(site II)疏水腔，導致BSA熒光穩(wěn)態(tài)猝滅.洛伐他汀與BSA的結合位點數均約為1，形成1∶1結合物，其結合常數(Kb)數量級為103.當洛伐他汀結合到BSA亞結構域IIIA(site II)后，導致BSA二級結構產生微小變化.兩者結合過程中，吉布斯自由能(ΔG0)、焓變(ΔH0)和熵變(ΔS0)分別為-21.94 kJ/mol，-18.13 kJ/mol和12.84 J/(mol·K)，表明洛伐他汀與BSA結合是一個自發(fā)的過程，其主要作用力是疏水作用和氫鍵作用.

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