，，，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy, DR)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥，帶給患者極大的痛苦.同時，DR也是當前人類致盲的主要原因之一，且發(fā)病人數(shù)以每年15%的速度遞增[1-2]，而糖尿病患者隨著病情加深其失明的可能性是普通人的25～30倍.DR的發(fā)病機理目前仍不清楚，可能與高糖導(dǎo)致的一系列功能和生化代謝異常有關(guān).以往研究認為，導(dǎo)致DR的原因包括：血液流變學(xué)異常[3]，多元醇通路活化[4]，氧化應(yīng)激增多[5-6]，晚期糖基化終產(chǎn)物積聚[7]，細胞因子活化以及基因影響等[8-9].脂肪酸是視網(wǎng)膜的主要組分，其組成變化是包括糖尿病視網(wǎng)膜病變在內(nèi)的多種視網(wǎng)膜病變發(fā)生和發(fā)展的原因和基礎(chǔ)，已有研究表明高血脂將提高糖尿病人視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率.而視網(wǎng)膜中n-3/n-6長鏈多不飽和脂肪酸的比例發(fā)生改變也與多種視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展有關(guān).

現(xiàn)代研究認為，炎性因子的表達與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系.白介素6(Interleukin 6，IL-6)是一種促炎性因子，可以引起急性炎癥反應(yīng)并且增加血管通透性[10].IL-6已被證明可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達有效促進血管新生[10-11].也有實驗證明IL-6表達的水平與DR的嚴重程度呈正相關(guān)[12-13].VEGF是最直接的眼球內(nèi)新生血管生長因子，在高血糖環(huán)境中，視網(wǎng)膜及相關(guān)組織處于缺氧狀態(tài)，可刺激VEGF的表達，而VEGF則促進新血管形成，并改變血管通透性的能力[14].John PS等[15]對長鏈多不飽和脂肪酸影響視網(wǎng)膜健康與病變做了全面的綜述，他們認為n-3長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)，特別是DHA是視網(wǎng)膜的重要組成部分，影響著視網(wǎng)膜的健康和功能.同時，PUFAs對炎性因子及VEGF表達有顯著影響，EPA可以有效抑制VEGF特異性酪氨酸激酶受體的激活及表達.在前人研究的基礎(chǔ)上，筆者著重探索了PUFAs對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響，通過構(gòu)建RF/6A細胞高糖逆境模型，研究了AA，EPA及DHA三種長鏈多不飽和脂肪酸對高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的RF/6A細胞過度增殖的影響，并通過分析高糖環(huán)境對PUFAs吸收的影響，RF/6A細胞脂肪酸組成以及IL-6和VEGF表達水平的變化，以期揭示PUFAs對糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響及其作用機制，為后續(xù)糖尿病視網(wǎng)膜病變防治藥物的開發(fā)和探索提供新的實驗和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

RF/6A購買自中國科學(xué)院細胞庫；胎牛血清購買自杭州四季青生物工程材料有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胰蛋白酶和牛血清白蛋白購自上海生物工程有限公司；青霉素及鏈霉素購自杭州紅會醫(yī)院；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽、花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)購自美國Sigma公司.

1.2 RF/6A細胞培養(yǎng)

RF/6A細胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液，pH 7.2.培養(yǎng)液中添加10%已滅活胎牛血清和雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL).細胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h換液，每72 h傳代一次.細胞培養(yǎng)及分析用容器徹底清洗后用124 ℃濕熱滅菌30 min.

1.3 脂肪酸樣品的配制

將AA，EPA,DHA樣品溶解于無水乙醇中并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌配制成濃度為20 mmol/L的儲備液，-20 ℃儲存.將PUFAs的儲備液用含有無脂肪酸牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)液稀釋至60～200 μmol/L.BSA將被作為PUFAs的載體，脂肪酸與其的摩爾比維持在5∶1[16].

1.4 MTT分析

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)[17]分析是測試細胞存活率和代謝能力的一種常規(guī)手段.該方法主要是因為黃色的MTT可以被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶和細胞色素c代謝生成藍色不溶于水的甲臜(Formazan).甲臜可以溶于DMSO中并通過酶標儀在550 nm波長處測定光密度OD值.而死細胞則不能生成甲臜.MTT的配制：稱取MTT以5 mg/mL的濃度溶于磷酸緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃儲存?zhèn)溆?將處于對數(shù)生長期的RF/6A細胞接種于96孔板，細胞密度為104個/孔，培養(yǎng)24 h后，換液并加入一定濃度的處理試劑，每組設(shè)8個平行，對照孔加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后.取出96孔板并甩出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入20 μL的MTT，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，之后取出加入150 μL DMSO，用水平振蕩器使孔內(nèi)甲臜完全溶解，然后用酶標儀在550 nm處OD值.存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%.

1.5 細胞脂肪酸組分測定

將處于對數(shù)生長期的RF/6A細胞接種于細胞瓶中用含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞密度為3×105個/瓶.培養(yǎng)24 h后，吸出以前的培養(yǎng)液，每瓶加入5 700 μL含體積分數(shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和300 μL的處理試劑.培育結(jié)束以后，用胰酶消化離心收集，用PBS沖洗兩遍后轉(zhuǎn)入離心管中快速加入體積分數(shù)為5%鹽酸甲醇3 mL，立即密封放入100 ℃恒溫箱中，反應(yīng)3 h，然后取出冷卻至室溫，加入等體積的高純水，用3 mL正己烷分三次萃取，回收正己烷相，用無水硫酸鈉除水并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，氮氣吹干，用正己烷定容至100 μL并進樣至安捷倫氣相色譜(Agilent 7890A)，色譜柱為DB-23(0.25 mm，60 m).程序升溫條件：130 ℃保留1 min，6.5 ℃/min升至180 ℃，然后2.5 ℃/min升至225 ℃并保持10 min.

1.6 VEGF和IL-6的檢測

將處于對數(shù)生長期的RF/6A細胞接種于六孔板瓶中用含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞密度為2×105個/瓶.培養(yǎng)24 h后，吸出以前的培養(yǎng)液，每瓶加入3 800 μL含體積分數(shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和200 μL的處理試劑.培養(yǎng)結(jié)束以后將培養(yǎng)液分裝到離心管中密封儲存于-20 ℃冰箱中備用.利用市面上可以購買到的猴源VEGF和IL-6 ELISA試劑盒來檢測培養(yǎng)液中由細胞所表達的VEGF和IL-6的水平，分別按照其試劑盒說明書操作，最后在酶標儀中以450 nm波長檢測吸光度.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用t-test和SPSS 14.0進行，繪圖采用Microsoft Excel 2003進行，數(shù)值表示為平均值±SD.

2 結(jié)果與討論

2.1 高濃度葡萄糖對RF/6A細胞生長的影響

選用40，50，60，70 mmol/L濃度的D-葡萄糖處理RF/6A細胞，采用MTT法測定細胞存活率.由圖1可知：作用72 h，50 mmol/L及60 mmol/L葡萄糖處理能誘導(dǎo)RF/6A細胞大量增殖(**為p<0.01)，而70 mmol/L葡萄糖處理，RF/6A細胞存活率有下降趨勢，較對照無顯著性差異，故選擇60 mmol/L葡萄糖處理構(gòu)建高糖模型.同時，由圖2可知：40～70 mmol/L甘露醇處理對RF/6A細胞生長無影響，說明高糖誘導(dǎo)的RF/6A細胞存活率變化與滲透壓無關(guān).

圖1 葡萄糖處理72 h對RF/6A細胞存活率的影響

圖2 不同濃度甘露醇作用72 h對存活率的影響

2.2 長鏈多不飽和脂肪酸對高糖環(huán)境下RF/6A細胞生長的影響

采用120，140，160，180，200 μmol/L濃度的AA，EPA及DHA處理高糖環(huán)境下的RF/6A細胞，圖3顯示，高糖與PUFAs共同處理下，隨著PUFAs濃度的升高，RF/6A細胞存活率先升高后降低.AA濃度為180 μmol/L可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細胞增殖，其存活率與空白細胞無顯著性差異；EPA濃度為160 μmol/L時可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細胞增殖；200 μmol/L DHA處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細胞增殖.因此，本實驗選擇180 μmol/L AA，160 μmol/L EPA及200 μmol/L DHA用于后續(xù)研究.

2.3 長鏈多不飽和脂肪酸及高濃度葡萄糖對RF/6A細胞脂肪酸組成的影響

采用葡萄糖及PUFAs處理RF/6A細胞，并采用氣相色譜測定不同處理RF/6A細胞脂肪酸組成.由表1,2可知：高糖處理的RF/6A細胞，細胞培養(yǎng)基中無添加脂肪酸的情況下，脂肪酸組成較空白對照組變化不明顯；AA，EPA及DHA處理均能改變RF/6A細胞脂肪酸組成.同時，AA處理RF/6A細胞，細胞中AA的質(zhì)量分數(shù)顯著升高(45.29%)，而AA與高糖同時處理，則AA含量較AA單獨處理組高(63.24%)，說明高糖環(huán)境促進了RF/6A細胞對AA的吸收.EPA和DHA單獨處理RF/6A細胞，分別使細胞中EPA和DHA含量升高(EPA=8.26%；DHA=14.87%)；而高糖環(huán)境下，EPA和DHA單獨處理后，RF/6A細胞中EPA和DHA含量較單獨EPA、DHA處理降低(EPA的質(zhì)量分數(shù)為6.20%；DHA的質(zhì)量分數(shù)為8.92%)，則說明高糖環(huán)境抑制了RF/6A細胞對EPA和DHA的吸收.由此，高糖環(huán)境可改變視網(wǎng)膜細胞對不同種類脂肪酸的吸收，這可能是高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜脂肪酸組成變化的重要機制.

1—空白對照組；2—60 mmol/L葡萄糖模型組；3—120 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖處理組；4—140 μmol/L 脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖處理組；5—160 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖處理組；6—180 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖處理組；7—200 μmol/L脂肪酸和60 mmol/L葡萄糖處理組；*為p<0.05;** 為p<0.01

表1 PUFAs和葡萄糖處理的RF/6A細胞的脂肪酸組分1)

表2 高濃度葡萄糖及PUFAs對RF/6A細胞S/U及n-6/n-3比例的影響1)

采用n-6長鏈多不飽和脂肪酸AA處理RF/6A細胞，細胞中n-3脂肪酸含量顯著升高，而n-6脂肪酸含量較空白及高糖處理降低；而在高糖環(huán)境下，采用AA處理，RF/6A細胞中n-6脂肪酸含量顯著提高，可達80.35%.采用EPA處理，RF/6A細胞中n-3脂肪酸含量顯著提高，而高糖環(huán)境下，EPA處理則使RF/6A細胞中n-6脂肪酸含量升高，而n-3脂肪酸含量較EPA單獨處理時降低.同時，采用DHA處理，RF/6A細胞中n-3脂肪酸含量顯著提高，在高糖環(huán)境下，n-3及n-6脂肪酸含量均明顯降低，而n-9及SFA含量提高.由此，高糖環(huán)境不僅影響RF/6A細胞對脂肪酸的吸收，也影響RF/6A細胞脂肪酸代謝.另一方面，本實驗結(jié)果也表明三種長鏈多不飽和脂肪酸處理對RF/6A細胞脂肪酸組成有影響.

2.4 長鏈多不飽和脂肪酸及高濃度葡萄糖對RF/6A細胞VEGF及IL-6表達的影響

由圖4可知：高糖處理下，RF/6A細胞中IL-6濃度提高；AA處理對高糖誘導(dǎo)的IL-6表達有促進作用.而采用EPA及DHA處理后，IL-6濃度較高糖處理顯著降低，與空白對照無顯著性差異，表明兩種n-3長鏈多不飽和脂肪酸對高糖誘導(dǎo)的IL-6表達具有抑制作用.

1—空白對照組；2—60 mmol/L葡萄糖模型組；3—180 μmol/L AA和60 mmol/L葡萄糖處理組；4—160 μmol/L EPA和60 mmol/L葡萄糖處理組；5—200 μmol/L DHA和60 mmol/L葡萄糖處理組；*為p<0.05;**為p<0.01

由圖4可知：高糖處理下，RF/6A細胞中VEGF濃度升高，但與空白對照組無顯著性差異；而采用三種長鏈多不飽和脂肪酸處理后，VEGF含量較高糖處理升高，特別是AA及EPA對VEGF表達具有顯著促進作用，而DHA處理VEGF濃度較對照組無顯著性差異.

由此，高濃度葡萄糖顯著促進IL-6表達，可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要機制；高糖環(huán)境下，AA處理促進了IL-6及VEGF表達；EPA處理能顯著抑制IL-6表達，但對VEGF表達有促進作用；DHA處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的IL-6表達，對VEGF表達無顯著性促進作用.由此，DHA在糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治方面更具開發(fā)潛力，而其作用機制仍值得進一步探索.

3 結(jié) 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變一般分為兩個階段.第一個階段為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變，其特點是黃斑水腫，微小血管瘤等.第二個階段為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變，其特點是有大量的新生血管形成，并極易造成視網(wǎng)膜脫落.不論是前期還是后期，內(nèi)皮細胞都表現(xiàn)為增殖.因此抑制內(nèi)皮細胞在高糖環(huán)境下增殖就成為相關(guān)藥物篩選的主要指標.實驗結(jié)果表明：180 μmol/L AA，160 μmol/L EPA及200 μmol/L DHA可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細胞增殖.值得注意的是，三種長鏈多不飽和脂肪酸對RF/6A細胞增殖影響的結(jié)果背后存在不同的機理.氣相色譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種長鏈多不飽和脂肪酸處理對RF/6A細胞脂肪酸組成和代謝的影響不同.采用VEGF和IL-6 ELISA試劑盒檢測其結(jié)果則顯示，高糖環(huán)境下，AA處理組IL-6及VEGF含量均達到最高，這可能是因為在高糖脅迫的細胞模型中加入AA，可以刺激n-6脂肪酸的轉(zhuǎn)化和集聚.同時，AA又大量轉(zhuǎn)化成其他促炎分子，導(dǎo)致了大量的VEGF和IL-6的表達，而炎性因子的大量表達促使細胞凋亡，所以得到了180 μmol/L AA處理組細胞增殖被抑制的情況.EPA處理后，細胞中的EPA部分轉(zhuǎn)化為抗炎分子，部分轉(zhuǎn)化為促炎分子，因此其可抑制IL-6表達，但對VEGF表達有一定的促進作用.DHA處理后，細胞中的DHA并不能直接轉(zhuǎn)化為促炎分子，但可轉(zhuǎn)化為抗炎分子，因此其對IL-6表達具有良好的抑制作用，對VEGF不表現(xiàn)促進作用.總體上，三種長鏈多不飽和脂肪酸處理，DHA對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細胞增殖具有最好的效果，值得進一步深入探索.

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