劉 升

(中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1973年Steinman[1]首次分離出樹突狀細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞是目前已知功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞，其激活T淋巴細(xì)胞的能力較巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞強(qiáng)100 ～ 1 000倍以上，并且是唯一能激活初始免疫應(yīng)答的抗原提呈細(xì)胞[2-4]。正如我國曹雪濤院士所闡述的，樹突狀細(xì)胞是人體內(nèi)數(shù)量極少且功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，是人體建立完善免疫學(xué)“防御機(jī)制”的基礎(chǔ)。隨著人們對樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性及功能的了解不斷加深并在某些疾病的基礎(chǔ)研究和臨床防控應(yīng)用中取得了令人鼓舞的成果，樹突狀細(xì)胞的重要性也越來越受到人們的重視。

由于樹突狀細(xì)胞在外周血中含量極少，僅占單核細(xì)胞總數(shù)的0.1%～10%，分離純化困難，故臨床應(yīng)用受到極大限制，因此成熟的樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立是獲得足夠數(shù)量的具有功能作用的樹突狀細(xì)胞的另一重要有效途徑。近年來，在體外采用了多種不同的分化途徑誘導(dǎo)擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞的研究，包括用人臍血[5]、骨髓[6]和粒細(xì)胞集落刺激因子動員后外周血中的造血干/祖細(xì)胞或單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增[7]，并已獲得成功。用于培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞因子有很多，其中主要有粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素4、干擾素α、Flt3配體和白細(xì)胞介素13等[8]，在相差顯微鏡及電鏡下觀察，所培養(yǎng)的細(xì)胞均具有典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)特征，均明顯有別于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[9]。

樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)分布廣泛，但數(shù)量較少，因此如何獲得大量的樹突狀細(xì)胞就成為進(jìn)一步研究樹突狀細(xì)胞特性和功能的前提。豚鼠由于其在生理學(xué)與免疫應(yīng)答等方面與人類有極高的相似性，并且關(guān)于豚鼠樹突狀細(xì)胞相關(guān)的研究報(bào)導(dǎo)很少，因此，我們的實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)擴(kuò)增了豚鼠骨髓樹突狀細(xì)胞，為優(yōu)化樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)和建立能獲得大量具有抗原提呈功能的樹突狀細(xì)胞的方法體系提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

豚鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑

重組粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)(美國Tepro-tech公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液、紅細(xì)胞裂解液、體積分?jǐn)?shù)為75% 乙醇(實(shí)驗(yàn)室自配)；胎牛血清(美國 Hyclone公司)、青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、結(jié)核分枝桿菌弱毒卡介苗(BCG)(實(shí)驗(yàn)室保存)；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海薩博生物有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(江蘇凈化儀器制造廠)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)；離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡(日本OLMPUS，IX71)；流式細(xì)胞儀 、電子天平(德國 METTLER)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 豚鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)[3-5]

2.1.1 豚鼠骨髓細(xì)胞的制備 將豚鼠脫頸處死,無菌操作取出股骨、脛骨及肱骨,盡量將肌肉和結(jié)締組織去除。切除取出的骨的兩端,在含有青、鏈霉素雙抗的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用5 mL無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓。將沖洗液收入15 mL離心管中，以1∶5 的體積比加入37 ℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打混勻，置室溫5 min，離心， 1 000 r/min，5 min，棄上清液除去紅細(xì)胞，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1次，離心收集沉淀的骨髓細(xì)胞[10]。

2.1.2 樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng) 將骨髓細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 mL體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清及雙抗(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液。將細(xì)胞輕輕搖勻置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后，吸取未貼壁的懸浮細(xì)胞，再用培養(yǎng)液輕輕沖洗以去除非貼壁細(xì)胞，即獲得貼壁的單核細(xì)胞[11-12]。

將細(xì)胞分為細(xì)胞因子誘導(dǎo)組和對照組。誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)液中添加誘導(dǎo)因子GM-CSF、IL-4(濃度分別為20 μg/L和10 μg/L),每2 d換液1次。

2.2 樹突狀細(xì)胞的表型鑒定與特性分析

2.2.1 倒置顯微鏡觀察 在倒置顯微鏡下觀察樹突狀細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化，并拍照。

2.2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗3次，用40 g/L 的多聚甲醛室溫固定30 min，固定的細(xì)胞用PBST(含有體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Triton X-100)洗滌3次后，用PBST在室溫下透膜10 min，洗滌后細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%山羊血清和 50 g/L脫脂奶粉的PBST中，室溫下封閉30 min。然后置于用含20 g/L脫脂奶粉、體積分?jǐn)?shù)為10 %山羊血清的PBST稀釋后的CD14一抗中，4 ℃冰箱過夜。用PBST洗滌3次，室溫下置于用含20 g/L脫脂奶粉、體積分?jǐn)?shù)為10% 山羊血清的PBST稀釋后的二抗中，孵育1 h[鼠抗CD14，1∶100，二抗為熒光標(biāo)記的goat anti-mouse IgG+IgA+IgM( H+L )FITC conjugate][12-13]。熒光顯微鏡下拍照。

2.2.3 BCG誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞凋亡分析 取12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別接種濃度為5.0×105/mL的樹突狀細(xì)胞1 mL，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細(xì)菌∶細(xì)胞=100∶1的比例，每孔加入濃度為5.2×107CFU/mL 的BCG懸液 1 mL，37 ℃ 孵育24 h， PBS 洗3次，然后分別用 Annexin V-FITC 和 Propidiumiodide( PI) 染色，按 Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明書，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。未用BCG刺激培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞為對照組[14-15]。

3 結(jié)果

3.1 體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞倒置顯微鏡觀察結(jié)果

由豚鼠骨髓直接分離的樹突狀細(xì)胞量很少,經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3 d后樹突狀細(xì)胞量逐漸增多, 2周后細(xì)胞計(jì)數(shù)擴(kuò)增至70%～80%。

在倒置顯微鏡下可見，培養(yǎng)1 d的細(xì)胞貼壁生長, 有細(xì)胞聚集現(xiàn)象, 呈均勻分布的細(xì)胞集落，細(xì)胞體積小,形狀不規(guī)則,邊緣可見細(xì)小偽足,無樹枝樣突起。培養(yǎng)3 d后,細(xì)胞成簇生長,大多數(shù)細(xì)胞仍然貼壁,少數(shù)細(xì)胞處于半懸浮狀態(tài),細(xì)胞體積與以前接近,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，較小,細(xì)胞周邊可見毛刺狀突起,但毛刺較短,分枝較少。培養(yǎng) 5 d后,較多細(xì)胞呈半懸浮生長,可見大部分細(xì)胞呈梭形及不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積較以前增大,分別聚集生長,周邊可見明顯的刺狀突起,突起較長,可見分枝。培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞體積較前增大,周邊刺突十分明顯,突起較粗大,分枝較明顯,細(xì)胞形態(tài)似星形或梭形,細(xì)胞核明顯,細(xì)胞聚集生長。培養(yǎng)10 d后,細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞體積增大,具有明顯樹枝狀突起,突起粗大且較長,胞體相對飽滿,細(xì)胞形態(tài)呈星形、多邊形或梭形。培養(yǎng)14 d后,大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)懸浮生長,呈現(xiàn)典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài), 細(xì)胞呈星形或梭形,形似“海星”細(xì)胞核清晰可見,細(xì)胞表面突起增多,細(xì)長,分支較多,呈蔓狀分布于細(xì)胞表面,形似樹枝狀。見圖1、圖2、圖3。

3.2 化學(xué)免疫檢測

經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的豚鼠樹突狀細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測，細(xì)胞呈CD14陽性。見圖4。

3.3 BCG誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞凋亡分析

流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V-FITC 標(biāo)記法檢測發(fā)現(xiàn)，BCG與樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞凋亡率為18.95%，顯著高于對照組4.3%。見圖5。

圖1 培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞

圖2 培養(yǎng)5 d后的細(xì)胞

圖3 培養(yǎng)10 d后的細(xì)胞

a：相差顯微鏡；b：熒光顯微鏡。

a：BCG與樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h組；b：對照組。

4 分析與討論

我們的實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)的豚鼠樹突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫表型進(jìn)行了鑒定，保證了培養(yǎng)體系的正確。形態(tài)學(xué)方面,骨髓中單核細(xì)胞在培養(yǎng)3 d以后,部分細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則的樹突樣突起,與相關(guān)文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。樹突狀細(xì)胞成熟與否與其表面標(biāo)記分子表達(dá)程度的高低有關(guān)。在樹突狀細(xì)胞的表型鑒定方面,豚鼠的表面標(biāo)記物中較為常用的為MHC2II類表面黏附分子CD14，可作為豚鼠DC表面的特異性標(biāo)記物[14]。實(shí)驗(yàn)將豚鼠的特異性標(biāo)記CD14作為鑒定的指標(biāo),其表達(dá)符合樹突狀的成熟狀態(tài)。誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡是許多病原微生物重要的致病機(jī)制[15-16]。實(shí)驗(yàn)中BCG與樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞凋亡率為18.95%，顯著高于對照組4.30%，從而提示BCG在與樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)中可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞發(fā)生凋亡。據(jù)此推測，這種BCG誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的凋亡作用，可能對有效地控制結(jié)核分枝桿菌在胞內(nèi)的生存、繁殖和擴(kuò)散有著重要的意義。

我們的實(shí)驗(yàn)所采用的樹突狀細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的方法，成功建立了體外獲得大量成熟樹突狀細(xì)胞的方法體系，為進(jìn)一步研究樹突狀細(xì)胞的特性和功能提供實(shí)驗(yàn)材料，而且培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞具有一定的純度和保持體內(nèi)樹突狀細(xì)胞所具有的生物學(xué)特征。這不僅為樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供了有效的研究方法，而且也為在細(xì)胞水平研究樹突狀細(xì)胞的表型、功能及免疫治療等提供可靠的體外實(shí)驗(yàn)材料。

(從課題的選擇到實(shí)驗(yàn)的過程再到論文的撰寫，均在吳月紅教授的悉心指導(dǎo)下完成。在此，對我的導(dǎo)師吳月紅教授致以誠摯的謝意。)

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