李江曼，韓雪娜，袁 果,2，陳莉莎,2，侯志超，戶彥龍,2，李 丹,3，黃 佳，王立東,2*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450052;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003;3.河南省榮康醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

提取優(yōu)質(zhì)的基因組DNA是目前腫瘤分子生物學(xué)研究能否取得重要結(jié)果的關(guān)鍵。外周血標(biāo)本采集方便，不受地點(diǎn)、時(shí)間等客觀因素的影響，是腫瘤分子生物學(xué)研究中使用最廣泛的標(biāo)本。血樣離體后可立即進(jìn)行預(yù)處理，甚至立即提取DNA、RNA等。但是在科研實(shí)踐中，病例標(biāo)本來源多零散，采集的血液樣品不能立即處理，需要暫時(shí)存放，甚至在-70 ℃以下[1]的深低溫冰箱存放數(shù)年，待收集樣品達(dá)一定數(shù)量后才能開始進(jìn)行研究。提取DNA質(zhì)量的好壞對(duì)研究有很大影響[2]。冰凍外周血標(biāo)本提取DNA的質(zhì)量是否受存放時(shí)間的影響尚不十分清楚。為此，我們通過分析比較-80 ℃凍存1 a、2 a、3 a和4 a的外周血標(biāo)本提取DNA質(zhì)量，為研究者提供凍存時(shí)間對(duì)外周血提取DNA質(zhì)量影響的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

40例血液標(biāo)本(-80℃儲(chǔ)存1 a、2 a、3 a和4 a的標(biāo)本各10例)均來自河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室生物樣品資料庫。血樣采集：在采集對(duì)象知情同意的情況下，抽取5 mL空腹外周靜脈血，EDTA-K2抗凝[3]，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

DNA提取試劑盒FlexiGene DNA Kit(250)[4]購于Qiagen公司。全血標(biāo)本從-80℃冰箱里取出后，進(jìn)行梯度解凍(-40 ℃ 24 h，-20 ℃ 24 h，4 ℃ 24 h)。取450 μL全血樣品，按試劑盒提供方法進(jìn)行DNA抽提。提取DNA置4 ℃冰箱待用。

1.3 DNA質(zhì)量檢測

DNA電泳：采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖進(jìn)行電泳，BTS-20.M全自動(dòng)數(shù)字顯影凝膠成像系統(tǒng)和LUV-260D紫外線投射儀進(jìn)行圖像采集。

DNA濃度和純度：采用NanoDrop-2000型全波長紫外線/可見光掃描分光光度計(jì)檢測DNA 濃度和OD260/OD280比值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 凍存1～4 a的外周血提取DNA瓊脂糖凝膠電泳顯影

凝膠成像系統(tǒng)可見DNA電泳條帶均勻、整齊，近加樣孔處有一分子量較大的致密熒光條帶。見圖1所示，不同凍存年份全血樣品提取DNA的電泳結(jié)果相比基本一致。

圖1 凍存1～4 a外周血DNA瓊脂糖電泳(自上而下分別為1 a、2 a、3 a、4 a)

2.2 凍存1～4 a的外周血提取DNA濃度和OD260/OD280值比較

凍存1～4 a外周血提取DNA濃度有明顯差異(F=2.665，P=0.045，表1)，DNA純度(OD260/OD280)也有差異(F=2.954，P=0.045，P<0.05，表1)。兩兩比較結(jié)果顯示，凍存1 a、2 a和3 a的外周血DNA濃度之間無差異(P>0.05)，凍存4 a的外周血DNA濃度與凍存1～3 a的外周血DNA濃度有明顯差異(P<0.05)。隨著樣品凍存時(shí)間的延長，提取DNA濃度呈逐漸降低的趨勢。凍存1 a的外周血提取DNA的純度明顯優(yōu)于2 a及以上的樣品(P<0.05)，凍存2～4 a的外周血DNA純度無明顯差異(P>0.05)。

表1 凍存1～4 a外周血提取DNA濃度和OD260/OD280值比較

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn),-80 ℃凍存1～3 a的外周血提取DNA濃度無明顯差異，但凍存4 a的外周血標(biāo)本提取DNA濃度明顯降低，凍存2 a及以上的外周血標(biāo)本提取DNA的純度明顯降低。外周血標(biāo)本凍存時(shí)間對(duì)標(biāo)本提取DNA的質(zhì)量有明顯的影響。我們僅通過比較提取DNA的濃度和純度來討論凍存時(shí)間對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響，針對(duì)不同年份濃度和純度相似的DNA在進(jìn)行PCR時(shí)是否有差異，我們還未進(jìn)行討論。有研究[5]報(bào)道，簡易凍存2～4周的外周血標(biāo)本與新鮮標(biāo)本提取的DNA在進(jìn)行PCR時(shí)無明顯差異。

影響外周血DNA提取質(zhì)量的因素有很多，新鮮標(biāo)本采集后建議4 ℃儲(chǔ)存一周，長時(shí)間保存需放入深低溫冰箱。標(biāo)本采集后應(yīng)上下混勻，以免形成血凝塊，影響DNA的提取。在標(biāo)本運(yùn)輸過程中儲(chǔ)存箱溫度應(yīng)保持在4 ℃，盡量減少顛簸。

綜上所述，凍存時(shí)間對(duì)外周血DNA提取有明顯的影響，凍存1 a的外周血提取DNA的純度較2 a及以上的樣品優(yōu)，凍存4 a的樣品提取DNA的濃度明顯降低。

參考文獻(xiàn)：

[1] J薩姆布魯克，DW拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3版.北京：科學(xué)出版社，2003：463.

[2] Utsuno H, Minaguchi K. Influence of template DNA degradation on the genotyping of SNPs and STR polymorphisms from forensic materials by PCR [J]. Bull Tokyo Dent Coll, 2004, 45(1):33.

[3] 朱玉蓉，李金田，張曉梅.細(xì)胞裂解法提取全血基因組DNA及兩種抗凝劑對(duì)其結(jié)果的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2008，12(1)：73.

[5] 胡衛(wèi)華，李鐵臣，孫惠蘭.凍存血與新鮮血的DNA抽提效果的比較研究[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24(2)：96.