李 丹，劉亞麗，劉 靜，李 燕，劉 玉，李江曼，袁 果，王立東*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450052;2.河南省榮康醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

石蠟包埋組織(paraffin embedded tissues，F(xiàn)FPET)是形態(tài)學(xué)研究中的重要資源。近年來，采用石蠟組織進(jìn)行分子病理學(xué)檢測，如腫瘤相關(guān)基因的突變[1]、靶向藥物的分子檢測[2]等已迅速從科研領(lǐng)域發(fā)展到常規(guī)的病理診斷?；仡櫺缘幕蜓芯吭诂F(xiàn)在的腫瘤分子生物學(xué)研究中越來越廣泛，科研中采集的組織標(biāo)本多為石蠟包埋組織，因此提取DNA的質(zhì)量將直接影響分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。長時(shí)間保存的石蠟組織提取DNA能否滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，成為許多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)問題。我們通過比較儲(chǔ)存1～3 a的石蠟組織提取DNA的濃度和純度，討論常溫儲(chǔ)存時(shí)間對石蠟包埋組織DNA質(zhì)量的影響。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

30例石蠟組織(常溫儲(chǔ)存1 a、2 a和3 a的組織各10例)均來自河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室。

組織挑選原則：用直尺測量石蠟組織對應(yīng)HE切片大小，低倍鏡觀察，腫瘤組織占整個(gè)組織面積的百分比，選擇中低分化組織，腫瘤組織在80%以上的蠟塊，計(jì)算實(shí)際腫瘤組織面積=蠟塊的長(cm)×寬(cm)×腫瘤組織面積占蠟塊組織面積的百分比(%)，挑選實(shí)際腫瘤組織面積在2 cm2左右的組織。

常規(guī)消毒所用物品，20 um厚連續(xù)切膜4片，放入2 μL PE管中備用。

1.2 DNA提取

DNA提取試劑盒購于上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司。石蠟組織先經(jīng)二甲苯脫蠟(1 mL二甲苯，55 ℃水浴10 min，13 000轉(zhuǎn)離心5 min)3次，無水乙醇洗滌(1 mL無水乙醇，震蕩混勻，13 000轉(zhuǎn)離心5 min)2次，標(biāo)本60 ℃烘干備用。組織脫蠟處理后，按試劑盒提供方法進(jìn)行DNA抽提。提取DNA置4 ℃冰箱待用。

1.3 DNA質(zhì)量檢測

DNA電泳：采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖進(jìn)行電泳，采用BTS-20.M全自動(dòng)數(shù)字顯影凝膠成像系統(tǒng)和LUV-260D紫外線投射儀進(jìn)行圖像采集。

DNA濃度和純度：采用NanoDrop-2000型全波長紫外線/可見光掃描分光光度計(jì)檢測DNA濃度和OD260/OD280比值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組樣本間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α<0.05。

2 結(jié)果

2.1 石蠟包埋組織DNA瓊脂糖凝膠電泳顯影

瓊脂糖凝膠電泳顯示：石蠟包埋組織DNA基因組DNA幾乎不可見，僅有兩例儲(chǔ)存1 a的石蠟包埋組織可見基因組DNA。DNA降解明顯，見圖1。

圖1 石蠟組織DNA瓊脂糖凝膠電泳圖(自上而下分別為儲(chǔ)存1 a、2 a、3 a的石蠟組織提取的DNA)

2.2 儲(chǔ)存1～3 a的石蠟包埋組織DNA濃度和純度比較

石蠟包埋組織儲(chǔ)存時(shí)間越長，提取DNA的濃度越低，儲(chǔ)存1～3 a的石蠟包埋組織提取DNA的濃度存在明顯差異(F=3.96，P=0.04)。兩兩比較，儲(chǔ)存1 a的組織提取DNA的濃度明顯高于儲(chǔ)存3 a(P<0.05)，儲(chǔ)存1 a與2 a和儲(chǔ)存2 a與3 a的組織提取DNA濃度無差異(P>0.05)。儲(chǔ)存1～3 a的石蠟包埋組織提取DNA的純度無明顯差異(F=1.67，P=0.21),見表1。

表1 石蠟組織切片提取DNA濃度和OD260/OD280值

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)，石蠟包埋組織儲(chǔ)存時(shí)間越長提取DNA的質(zhì)量越差，且石蠟包埋組織DNA降解嚴(yán)重。組織在用石蠟包埋前需脫水固定，臨床上采用的多為甲醛。甲醛是最小的含氧有機(jī)物，具有較高的反應(yīng)活性，可提供亞甲基(-CH2-)與帶有羥基(-OH)、巰基(-SH)和氨基(-NH2)的分子反應(yīng)，使自由的分子鏈交聯(lián)起來，從而發(fā)揮對組織的的固定作用，同時(shí)也對DNA分子產(chǎn)生不利作用。隨著固定時(shí)間的延長，生物大分子之間緩慢形成廣泛的亞甲基交聯(lián)橋，導(dǎo)致DNA鏈的脆性增加，使DNA分子更易發(fā)生隨機(jī)的斷裂[3]。

組織在浸蠟和包埋時(shí)需將石蠟加熱到62 ℃左右，此時(shí)DNA部分解鏈，組織內(nèi)殘留的痕量甲醛可對解鏈后的DNA單鏈進(jìn)行甲基化修飾，修飾后的DNA單鏈在冷卻后不易復(fù)性而導(dǎo)致降解[4]。

在DNA的提取過程中，殘留的石蠟可阻礙消化液對組織的滲透，抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白的接觸，影響組織消化和DNA的釋放。文獻(xiàn)[5]對比觀察切片厚度為2.5 um、5.0 um和10.0 um三種情況下進(jìn)行二甲苯脫蠟后，提取DNA的質(zhì)量以10.0 um切片質(zhì)量最好。切片過薄易造成DNA的機(jī)械損傷，鱗狀上皮細(xì)胞的直徑在8 um左右，在我們的實(shí)驗(yàn)中切片厚度為20 um，盡量減少對DNA的機(jī)械性損傷。

綜上所述，石蠟組織是回顧性研究常采用的標(biāo)本，但其DNA降解嚴(yán)重，石蠟包埋組織儲(chǔ)存時(shí)間越長，提取DNA的質(zhì)量越差。我們應(yīng)根據(jù)研究目的基因的大小，進(jìn)行研究標(biāo)本的選擇，同時(shí)研究從石蠟組織中提取高質(zhì)量DNA的方法，也是一項(xiàng)非常有意義的課題。

參考文獻(xiàn)：

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[3] Moerkerk PT, Kessels HJ, Ten Kate J, et al. Southern and dot blot analysis of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples from colonic carcinomas [J]. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol， 1990,58(5):351.

[4] Mies C, Houldsworth J, Chaganti RS. Extraction of DNA from paraffin blocks for Southern blot analysis [J]. Am J Surg Pathol, 1991,15(2):169.

[5] 蓋寶東，房學(xué)東，金仲田，等.提高石蠟包埋組織中提取DNA質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，29(1)：115.