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        膠體金免疫層析法檢測飼料中玉米赤霉烯酮的殘留

        2014-08-16 06:16:00劉宏軍馮才茂王瑟如吳發(fā)振余厚美仲曉蘭
        山東畜牧獸醫(yī) 2014年4期
        關(guān)鍵詞:赤霉烯酮紙條

        劉宏軍 馮才茂 王瑟如 吳發(fā)振 余厚美 仲曉蘭

        (①江蘇省泰州市姜堰區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 225500 ②北京勤邦生物技術(shù)有限公司)

        玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)為一種白色結(jié)晶,又稱F-2毒素,是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等動物源性食品,會對動物及人類造成危害,主要表現(xiàn)在影響和破壞生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面,人畜誤食含有該毒素的食物后,會引起雌性激素中毒癥,造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外,ZEN及其衍生物對肝臟系統(tǒng),免疫系統(tǒng)均有很大的危害,并且有引發(fā)腫瘤的可能性[1,2]。

        目前大多數(shù)國家對食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴(yán)格的規(guī)定。例如澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.05mg/kg;意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.1mg/kg;而在法國,植物油和谷類當(dāng)中玉米赤霉烯酮的含量必須低于0.2mg/kg。中國則規(guī)定配合飼料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超過500ng/g。

        玉米赤霉烯酮的分析測定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)[3-9]。TLC法繁瑣費時,且靈敏度、特異性較差,提取過程中所需有機(jī)溶劑品種多且量大,易污染環(huán)境,對人體有較大危害。常規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高,但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣,操作復(fù)雜,不宜推廣。以上包括ELISA法在內(nèi)的幾種方法均耗時較長,而隨著商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們對時間概念的加強(qiáng),無論是商家還是政府部門對檢測時間的要求越來越高,因此,膠體金試紙條作為一種快速檢測技術(shù),能很好的解決這個問題,提高檢測效率,縮減檢測時間。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        飼料樣品購自市場;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司;玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條來自北京勤邦生物技術(shù)有限公司;微量移液器購自美國Thermo公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 試樣制備 樣本前處理方法:稱取5.0±0.05g粉碎的飼料樣品至50ml聚苯乙烯離心管中,加入5ml甲醇,將瓶塞蓋緊,振蕩5min;室溫(20~25℃),3000r/min以上離心5min;移取0.1ml上清液至盛有0.9ml樣本復(fù)溶液的2ml聚苯乙烯離心管中混勻,渦動30s。陰性飼料樣品:空白飼料樣品經(jīng)前處理后,配制成濃度分別為0和該試紙條檢測限下限的1/2。陽性飼料樣品:空白飼料樣品經(jīng)前處理后,配制成濃度分別為該試紙條檢測限和檢測限的2倍。

        1.2.2 試紙條的使用步驟 用吸管吸取稀釋后的待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔;液體流動時開始計時,反應(yīng)5~10min,判定結(jié)果。

        1.2.3 結(jié)果判定 如果C線和T線都顯色,無論顏色深淺,均表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度低于檢測限,為陰性結(jié)果;如果C線顯色,T線不顯色,表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度等于或高于檢測限,為陽性結(jié)果;如果未出現(xiàn)C線,表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效(如附圖)。

        附圖 玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條示意圖

        1.2.4 檢測限的測定 用玉米赤霉烯酮試紙條分別對添加不同濃度的陰性飼料、陽性飼料進(jìn)行檢測,每個樣品做2個重復(fù),記錄每種呈現(xiàn)陽性的最低濃度值。如果檢測限下限濃度的陽性飼料樣品不呈現(xiàn)陽性,則根據(jù)檢測限(檢測限有下限和上限的則在檢測限內(nèi)選擇更高的濃度進(jìn)行檢測)配制濃度更高的陽性飼料樣品進(jìn)行檢測,直至出現(xiàn)陽性結(jié)果為止。

        1.2.5 假陽性率的測定 取空白的飼料樣品50份,制備B1、B2、B3、……、B50等100份陰性飼料樣品。對陰性飼料樣品用試紙條檢測,每個樣品做2個重復(fù),統(tǒng)計假陽性數(shù),按照下面的公式計算假陽性率。

        1.2.6 假陰性率的測定 取空白的飼料樣品50份,制備B1、B2、B3、……、B50等100份陽性飼料樣品,對陽性飼料樣品用試紙條檢測,每個樣品做2個重復(fù),統(tǒng)計假陰性數(shù),按照下面的公式計算假陰性率。

        2 結(jié)果

        用玉米赤霉烯酮試紙條對飼料進(jìn)行了檢測限、假陽性率、假陰性率驗證,結(jié)果如附表。

        附表 試紙條檢測結(jié)果

        3 討論

        玉米赤霉烯酮試紙條的檢測限為500ng/g,符合GB 13078.2-2006《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》。同時,國內(nèi)外對于快速檢測技術(shù)的一個基本原則是:絕不能有假陰性,但允許有假陽性,按照農(nóng)業(yè)部獸藥殘專家委員會《獸藥殘留檢測試紙條(條、卡)備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》,快速試紙條的假陽性率應(yīng)小于5%。本試紙條符合國家標(biāo)準(zhǔn)和該備案技術(shù)要求。

        玉米赤霉烯酮試紙條操作簡便,結(jié)果容易觀察,不需要任何設(shè)備,整個操作時間僅需5~10min,相對與儀器等方法,具有工作量小,成本低的明顯優(yōu)勢,十分適用于我國基層檢測實驗室、政府部門的市場監(jiān)控檢測、臨時抽檢、排查工作,能夠?qū)崿F(xiàn)生物技術(shù)在食品安全流通消費領(lǐng)域的方便、快速檢測[10]。

        [1]余濤, 李大剛, 鄧寧等.玉米赤霉烯酮多克隆抗體的制備及特性分析[J].食品與機(jī)械.2012, 28(1):78-81.

        [2]王元凱, 王君, 王雨晨.玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].微生物學(xué)通報, 2011, 38(12): 1793-1880.

        [3]曾紅燕, 黎源倩, 敬海泉.高效液相色譜法測定糧食中玉米赤霉烯酮及其代謝物[J].分析化學(xué), 2006, 34(3): 351-354.

        [4]曹鈺, 蔡國林, 陸健.提高豆粕營養(yǎng)價值的研究進(jìn)展[J].新飼料,2007(6): 13-15.

        [5]陸健.蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

        [6]王偉, 劉安法, 李明奇等.免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測小麥中玉米赤霉烯酮[J].糧食與飼料工業(yè).2013(4): 59-65.

        [7]應(yīng)永飛, 朱聰英, 韋敏玨等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中14種霉菌毒素及其類似物[J].分析化學(xué), 2010, 38(12): 1759-1764.

        [8]王雄, 榮釗, 蒙海超等.抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及ELISA檢測試劑盒的研制[J].飼料研究, 2010(11): 39-42.

        [9]王玉平, 計融, 江濤等.玉米赤霉烯酮ELISA定量檢測試劑盒研制[J].衛(wèi)生研究, 2006, 35(2): 221-224.

        [10]鄧省亮, 賴衛(wèi)華, 許楊.膠體金免疫層析法快速檢測黃曲霉毒素B1的研究[J].2007, 28(02): 232-236.

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