黃 勇，閆 駿,朱小軍

0 引言

前列腺癌容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，一般來(lái)講，患者前去就診之時(shí)，已有近一半的患者發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移[1-3]。從臨床經(jīng)驗(yàn)上看，前列腺癌患者出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移是一個(gè)重要的臨床特征，說(shuō)明患者的死亡率將大幅度升高[4]。但是，目前前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚不明了，對(duì)于癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移來(lái)講，其脫離原發(fā)病灶，繼而增強(qiáng)自身運(yùn)動(dòng)能力是前列腺癌細(xì)胞完成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[5]。因此，在臨床上鑒定E鈣粘素和波動(dòng)蛋白這兩種蛋白是研究前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要手段,而這兩種蛋白出現(xiàn)于LNCaP和IA8這兩種細(xì)胞株中，其中E鈣粘素與腫瘤關(guān)系十分密切，其下降時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞間的粘附力下降，最終細(xì)胞脫落，尤其在前列腺癌、肺癌及胃癌中，E-鈣粘素的下降，其腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移要高于其他腫瘤，且相關(guān)研究證實(shí)，E-鈣粘素的缺失，在前列腺癌細(xì)胞株中的表現(xiàn)較為明顯，可見(jiàn)其參與了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。而波形蛋白，其在浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中，會(huì)影響細(xì)胞骨架及細(xì)胞的生物學(xué)行為，它也是中間纖維的主要成分之一，所以，檢測(cè)為E鈣粘素和波形蛋白，對(duì)于臨床治療分期及藥物療效評(píng)估具有重要的意義。筆者從實(shí)驗(yàn)的角度對(duì)前列腺癌LNCaP和IA8兩種細(xì)胞株中的E鈣粘素以及波形蛋白的表達(dá)情況使用Western印跡法進(jìn)行鑒定，分析了不同轉(zhuǎn)移潛能以及在前列腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：LNCaP和IA8?？贵w及試劑：兔抗人多克隆E鈣粘素抗體，鼠抗人單克隆波形蛋白抗體，鼠抗人單克隆β-肌動(dòng)蛋白抗體，羊抗鼠和羊抗兔均進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記。顯色試劑盒采用NBT/BCIP試劑盒。培養(yǎng)液使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。1%的NP-40細(xì)胞裂解液：1%NP-40，150 mmol/L的NaCL，50 mmol/L的Tris，0.1%的SDS，200 μg/mL的PMSF，0.5%的脫氧膽鹽酸，50 μg/mL的抑肽酶，pH=7.4,考馬斯亮藍(lán)G-250。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI 1640培養(yǎng)液在含5%二氧化碳，溫度為37 ℃的孵化箱中進(jìn)行培養(yǎng)。消化傳代混合液使用1.25 g/L胰酶+0.2 g/L的EDTA。經(jīng)過(guò)胰酶消化和PBS沖洗液漂洗后，將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppend rof管內(nèi)。然后使用1% NP-40細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，劇烈震蕩后將細(xì)胞充分懸浮混合均勻，靜置于4 ℃的環(huán)境中0.5 h，然后使用離心機(jī)離心10 min，離心率為15 000 r/min，然后提取上清液總蛋白。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250定量之后，放入100 ℃沸水中煮10 min進(jìn)行變性。

1.2.2 Western印跡法 鑒定方法：選擇Western印跡法，每孔樣品為30 μg，使用10%的SDS-PAGE凝膠于80 V電壓之下進(jìn)行分離，然后將電壓調(diào)低至25 V，待SDS-PAGE凝膠上的蛋白半干后轉(zhuǎn)移至NC膜上，然后使用5%的脫脂奶粉將NC膜封閉，2 h之后，加入稀釋度為1∶100的兔抗人多克隆E鈣粘素抗體，鼠抗人單克隆的波動(dòng)蛋白抗體，以及鼠抗人單克隆的β-肌動(dòng)蛋白抗體。在4 ℃的孵化箱中孵化過(guò)夜，然后使用TPBS進(jìn)行充分漂洗后，加入經(jīng)過(guò)堿性磷酸酶標(biāo)記的稀釋度為1∶500的羊抗兔IgG和稀釋度為1∶200的羊抗鼠IgG，在孵化箱中孵化2 h后，使用NBT/BCIP試劑盒進(jìn)行顯色，再使用圖像分析儀進(jìn)行NBT/BCIP試劑盒顯色的條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)分析顯示，E鈣粘素在LNCaP中存在高表達(dá)，在IA8中卻缺失(圖1)，而波形蛋白卻在IA8中存在高表達(dá)，在LNCaP中缺失(圖2)，可見(jiàn)E鈣粘素和波形蛋白在LNCaP和IA8細(xì)胞表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而β-肌動(dòng)蛋白在二者的表達(dá)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但二者的E鈣粘素/β-肌動(dòng)蛋白及波動(dòng)蛋白/β-肌動(dòng)蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，具體見(jiàn)表1。

表1 LNCaP和IA8細(xì)胞株中的E鈣粘素、波形蛋白和β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)對(duì)比

圖1 E鈣粘素在LNCap以及IA8中的電泳結(jié)果

圖2 波形蛋白在LNCap以及IA8中的電泳結(jié)果

3 討論

前列腺癌容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，臨床前列腺癌的前期診斷不易，因此，一般患者前去就診之時(shí)，已經(jīng)有30%～50%的患者發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移[6]。前列腺腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，同時(shí)也是一個(gè)有序的過(guò)程。在整個(gè)的前列腺腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤存在著粘附性大幅度下降，基質(zhì)大部分降解和癌細(xì)胞的遷移性大幅度增強(qiáng)的臨床特征[7]。根據(jù)一般的臨床經(jīng)驗(yàn)，如果前列腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移就是一個(gè)非常重要的標(biāo)志性臨床特征，說(shuō)明至此之后患者的死亡率將大幅度提高[8]。這是因?yàn)榍傲邢侔┘?xì)胞之間的粘附性大幅度下降之后，癌細(xì)胞的自身運(yùn)動(dòng)能力得到了大幅度的增強(qiáng)，從而使癌細(xì)胞有可能脫離本來(lái)的原發(fā)病灶，對(duì)周?chē)慕M織進(jìn)行浸潤(rùn)，繼而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。一旦患者的前列腺癌細(xì)胞發(fā)生大規(guī)模的轉(zhuǎn)移，其必然會(huì)導(dǎo)致患者的全身細(xì)胞受到威脅，最終患者的死亡率將升高。

但是，目前對(duì)前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制還不十分清楚。對(duì)于癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，從上文的分析來(lái)看，癌細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，繼而增強(qiáng)自身運(yùn)動(dòng)能力是前列腺癌細(xì)胞完成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵條件。在前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，E鈣粘素和波動(dòng)蛋白發(fā)揮了非常重要的作用。因此，在臨床上鑒定E鈣粘素和波動(dòng)蛋白這兩種蛋白實(shí)現(xiàn)研究前列腺癌發(fā)展骨轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要手段。然而，這兩種蛋白主要存在于LNCaP和IA8這兩種細(xì)胞株中[10]。

E鈣粘素是鈣粘素家族中重要的一員,鈣粘素是一系列具有相似結(jié)構(gòu)和功能的單鏈跨膜糖蛋白族[11]。根據(jù)這些鈣粘素本身的來(lái)源進(jìn)行區(qū)分，可以分為神經(jīng)型鈣粘素(N)、上皮型鈣粘素(E)和胎盤(pán)型鈣粘素(P)3種。鈣粘素構(gòu)成細(xì)胞主要依賴(lài)于其本身的粘附性，其可以作為受體，對(duì)維持細(xì)胞之間的黏附和保持細(xì)胞的完整性有重要作用。但是，在三種類(lèi)型的鈣粘素中，E鈣粘素主要參與了前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如果E鈣粘素的表達(dá)降低，細(xì)胞之間的粘附性必然會(huì)大幅度下降，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的病變性脫落。其實(shí)，不僅僅是前列腺癌，在其他的諸如肺癌、頭部腫瘤、胃癌等惡性腫瘤中，E鈣粘素的低表達(dá)都提示了癌細(xì)胞存在轉(zhuǎn)移的特征。從研究文獻(xiàn)的結(jié)論上看，已經(jīng)有大量的研究表明，E鈣粘素的表達(dá)與上皮型的腫瘤轉(zhuǎn)移有著非常密切的關(guān)系。進(jìn)一步的研究表明，E鈣粘素表達(dá)的下降，甚至是缺失是與前列腺癌的轉(zhuǎn)移程度和能力之間存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系[11-12]。

然而，要完成前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，細(xì)胞的粘附性下降，最終脫落只是第一步，關(guān)鍵性的一步是細(xì)胞脫落之后運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。與此密切相關(guān)的是中間纖維，其中波動(dòng)蛋白就是其非常重要的一種中間纖維。其主要分布于上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，其與前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化，游走，遷移有著很大的關(guān)系。根據(jù)以往的研究結(jié)果，異常的波動(dòng)蛋白表達(dá)容易導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白的質(zhì)量發(fā)生根本性改變，使得細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)性的改變，上皮細(xì)胞由原來(lái)的立方型轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N纖維型，使得細(xì)胞更容易發(fā)生游走遷移，同時(shí)作為細(xì)胞內(nèi)部信息傳遞載體的細(xì)胞骨架蛋白排列發(fā)生了結(jié)構(gòu)性改變，嚴(yán)重干擾了細(xì)胞骨架與胞外基質(zhì)的跨膜反應(yīng)，使得粘著斑、微絲及膜受體之間的活性狀態(tài)發(fā)生了失控，不能調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和黏附，促進(jìn)了細(xì)胞解體和脫落，游走遷移。而相關(guān)研究得出，細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞骨架進(jìn)行傳遞的，其是一個(gè)有效載體，在正常狀態(tài)下，胞膜與細(xì)胞骨架是相連的，且與細(xì)胞外的基質(zhì)有跨膜反應(yīng)，其可以控制粘著斑以及微絲和膜受體的活性，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附與運(yùn)動(dòng)，而波形蛋白的異常表達(dá)，則可造成骨架系統(tǒng)排列出現(xiàn)變化，進(jìn)一步對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)產(chǎn)生干擾，促成了細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變[13-15]。本研究中，在IA8這種高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中，波形蛋白的表達(dá)要顯著高于LNCaP，從而再次證實(shí)了波形蛋白的上調(diào)，可以作為前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的一種體現(xiàn)，可促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，因此，可以通過(guò)這兩個(gè)蛋白，檢測(cè)癌癥發(fā)展進(jìn)程，對(duì)于指導(dǎo)用藥及判斷藥物療效具有重要的意義。

總之，前列腺癌患者的LNCaP和IA8細(xì)胞株中確實(shí)存在著E鈣粘素和波形蛋白表達(dá)差異，說(shuō)明E鈣粘素和波形蛋白在前列腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要促進(jìn)或者抑制作用，這對(duì)探討前列腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制并最終對(duì)抗前列腺癌有重要意義。

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