李飛保

青海民和縣疾病預(yù)防控制中心，青海民和 810800

當(dāng)前市場上流行的食品增稠劑越來越多，并且已經(jīng)投入到各類食品的生產(chǎn)，但卻尚未形成一套適用于食品增稠劑的科學(xué)的檢驗(yàn)方法[1]。在關(guān)于食品添加劑的微生物學(xué)指標(biāo)中，GB13886—2007檢驗(yàn)法直接引用國家食品安全中的微生物學(xué)檢驗(yàn)法GB4789進(jìn)行檢測；但有試驗(yàn)表明，該檢驗(yàn)方法對食品增稠劑的檢驗(yàn)明顯不符合規(guī)范，直接使用會(huì)造成檢驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際產(chǎn)生偏差，對食品增稠劑的微生物檢驗(yàn)是否會(huì)危害到人體健康這方面的檢驗(yàn)不科學(xué)。為此，本文專門選取5種高粘稠度的食品增稠劑樣本，進(jìn)行不同樣品的轉(zhuǎn)種量、濃度以及培養(yǎng)方式三方面的對比試驗(yàn)，并且對GB4789.4方法中的4類前增菌和增菌方法進(jìn)行改良，試驗(yàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗(yàn)材料：培養(yǎng)基，生化劑，沙門菌，大腸桿菌，志賀菌，金黃色葡萄球菌，刺槐豆膠，果膠，瓜爾膠，結(jié)冷膠，黃原膠，羧甲基纖維素鈉[2]；分別將瓜爾膠、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、刺槐豆膠、果膠以及結(jié)冷膠制成1:5的樣品，搖勻，使之在常溫下保持固體凝膠狀態(tài)；標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)壯后，制成約2CFU/mL備用菌懸液。

1.2 檢出率對比試驗(yàn)

前增菌：選取沙門菌，稱取20g，分別多次撒于盛有220 mLBPW（緩沖蛋白胨水）的無菌錐形瓶內(nèi)的液面上，使之在短時(shí)間可以快速均勻溶解完畢，用該溶液制成1:5的增菌液；再取5g1:5的該增菌液放入85 mLBPW無菌裝置中，900r/min的速度進(jìn)行無菌操作，大致持續(xù)2 min，停止后將該增菌轉(zhuǎn)移到另一裝置內(nèi)；重復(fù)使用該方法制備濃度為1:500的增均液。三類濃度不一樣的樣品制成后，分別添加1 mL、3 CFU/mL的菌懸液，攪拌使之混合均勻，置于35℃培養(yǎng)觀察15 h。

增菌：分別用無菌長柄勺攪勻培養(yǎng)過的樣品混合物，對三類樣品混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)種，取5g與1g的量到含有5mLTTB的培養(yǎng)裝置內(nèi)，置于43℃培養(yǎng)觀察20h。

1.3 振蕩培養(yǎng)與檢出率的關(guān)系

1.3.1 振蕩培養(yǎng)觀察 試驗(yàn)組前增菌制備：提取20g原樣品，不同量多次撒于含有220 mLIBPW的無菌裝置液面上，并使之快速溶解，攪拌均勻，制成樣品濃度為1:5的增菌液，取出該10 g濃度為1：5的增菌液放入盛有200 mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，繼續(xù)以900r/min的勻質(zhì)速度持續(xù)2 min的無菌操作，停止后將1:50的濃度增菌液轉(zhuǎn)入450 mL的裝置內(nèi)，再分別添加1 mL2x100的菌懸液，攪拌均勻使之溶解，置于35℃實(shí)行振蕩培養(yǎng)15 h。

增菌：使用無菌攪拌培養(yǎng)過的增菌液，分別提取8、1 mL的容量，轉(zhuǎn)種于 50 m與5 mLTTB內(nèi)，置于43℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.2 非振蕩培養(yǎng)觀察 培養(yǎng)方式同振蕩培養(yǎng)，樣本采取完成后進(jìn)行非振蕩培養(yǎng)20 h。

1.4 評定方法

建立好增稠劑致病菌的適用方法后，對增稠劑常見致病菌微生物的檢驗(yàn)方法進(jìn)行改良，即前增菌和增菌的檢驗(yàn)方法，對其改良后進(jìn)行比較試驗(yàn)，使用規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)的菌株菌懸液分別對黃原膠樣品逐一進(jìn)行加標(biāo)檢驗(yàn)和實(shí)際人員比對試驗(yàn)，各組分別抽取試驗(yàn)對比有效的結(jié)果以陽性對照組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，將其余3組操作人員的檢出率與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。

對實(shí)驗(yàn)設(shè)置三項(xiàng)對照內(nèi)容，具體為空白對照、陽性對照和樣品對照，每個(gè)對照所反映的指標(biāo)各有不同。其中，空白對照不添加任何成分，陽性對照僅添加菌液，而樣品對照也僅添加樣品。成立條件：陽性對照可以檢出，空白對照無法檢出，試驗(yàn)有效；樣品對照用于觀察樣品的初始染菌狀況。

2 結(jié)果

2.1 不同樣品的濃度、轉(zhuǎn)種量檢出率試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過前增菌試驗(yàn)，刺槐豆膠與果膠樣品都發(fā)生了變化。具體情況：樣品濃度的培養(yǎng)混合物已經(jīng)液化，全部成為液體，樣品對照物發(fā)現(xiàn)有菌類生長，經(jīng)研究其形態(tài)為非加標(biāo)菌形態(tài)，對照樣品已經(jīng)受到別類菌類的侵入，并破壞了加標(biāo)菌的完好生長，嚴(yán)重影響檢出率，因此，該樣品研究無效。此外，其他4種增稠劑樣品，濃度為1:5的樣品檢出率均達(dá)不到70%；濃度為1:50的樣品檢出率達(dá)不到90%；濃度為1:500的樣品濃度檢出率均能達(dá)到100%。

2.2 振蕩培養(yǎng)檢出率試驗(yàn)結(jié)果

除樣品對照有其他菌類的入侵導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果無效以外，其他對照組未出現(xiàn)雜菌，試驗(yàn)有效。其中，樣品濃度為1:5時(shí)，振蕩培養(yǎng)組與非振蕩培養(yǎng)組檢出率都較低；樣品濃度為1:50時(shí)，有1/50的轉(zhuǎn)種量同時(shí)采用振蕩培養(yǎng)的方式檢出率都能達(dá)到100%，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)前曾增菌培養(yǎng)使用振蕩培養(yǎng)，并且增加濃度到1:50時(shí)，檢出率明顯提高，另外，在一些增稠劑中添加適量的轉(zhuǎn)種量也可以有效提高檢出率。

2.3 增稠劑致病菌培養(yǎng)檢驗(yàn)法的建立

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，有效提高檢出率的辦法，是在取樣量保持一致的情況下[3]，將前增菌和增菌樣品濃度依次降低，使增稠劑樣品在前增菌和增菌的試驗(yàn)過程完全液化，取得的效果十分顯著。本次試驗(yàn)方法是在遵循傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的基礎(chǔ)下進(jìn)行改良，在操作過程中對各菌類樣本容量、濃度、培養(yǎng)方法等做相應(yīng)調(diào)整，具體方法建立步驟如下：

增稠劑檢驗(yàn)增容法：前增菌：稱取25g樣品放于盛有2500mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以9000r/min均質(zhì)2min進(jìn)行無菌操作，將增菌液轉(zhuǎn)移至2500 mL錐形瓶中，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察12 h。

增菌:用長柄無菌勺攪勻已培養(yǎng)過的增菌液，移取5 mL轉(zhuǎn)種于50 mLTTB內(nèi)，置于43℃振蕩培養(yǎng)20 h，同時(shí)，另取5 mL增菌液，轉(zhuǎn)種于50 mL混合有亞硝酸鹽胱氨酸的增菌液培養(yǎng)裝置內(nèi)，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察12 h。

2.3.1 增稠劑志賀菌培養(yǎng)法 同樣，稱取25g樣品放入盛有2500 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯中，900r/min均質(zhì)2 min，進(jìn)行無菌操作將增菌液轉(zhuǎn)移至500 mL錐形瓶中，置于43℃厭氧環(huán)境中振蕩培養(yǎng)20 h。

2.3.2 增稠劑致瀉大腸埃希菌培養(yǎng)法 采集致瀉大腸埃希菌樣品后立即檢驗(yàn)，取25g樣品，置于2500 mL盛有營養(yǎng)肉湯的無菌質(zhì)裝置內(nèi)，使用9000r/min的均質(zhì)1.5 min實(shí)行無菌操作，后轉(zhuǎn)移到5000 mL的錐形瓶中，置于36℃培養(yǎng)6 h；同時(shí)取5 mL樣品，轉(zhuǎn)種于50 mL盛有腸道菌增菌的肉湯內(nèi)，置于43℃培養(yǎng)觀察20 h。

2.3.3 增稠劑金黃色葡萄球菌培養(yǎng)法 取25g金黃色葡萄球菌樣品放入盛有2500 mL含有8%的氯化鈉肉湯裝置內(nèi)，以9000r/mind的速度進(jìn)行2 min的無菌操作，停止后將此增菌液轉(zhuǎn)移至5000 mL的裝置中，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察20 h。

2.4 結(jié)果確認(rèn)

本次試驗(yàn)，在4組致病菌檢驗(yàn)方法中，前增菌和增菌中樣品黃原膠加標(biāo)檢測結(jié)果表明，3組試驗(yàn)的檢出率都達(dá)到100%，在人員比對試驗(yàn)中達(dá)標(biāo)率為100%，方法確認(rèn)結(jié)果令人滿意。

3 討論

在當(dāng)前的食品市場上，對于食品增稠劑的使用越加廣泛，對于種種增稠劑是否會(huì)引入病菌帶到人體成了人們最關(guān)心的問題。國家有相關(guān)部門有規(guī)定，任何使用食品添加劑的單位都要進(jìn)行許可登記，并索要檢驗(yàn)情況憑證，如無食品合格證明，則對其按食品食品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，嚴(yán)格監(jiān)督。但該檢驗(yàn)對于食品增稠劑來說卻無法直接操作，在部分檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中直接采用國家食品安全中的微生物學(xué)檢驗(yàn)法如GB4789中，經(jīng)科學(xué)研究證明，該檢驗(yàn)方法不適合直接使用增稠劑致病菌的檢驗(yàn)。因此，為提高檢驗(yàn)方法的科學(xué)合理性，完善相關(guān)檢驗(yàn)法的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步改良或完善檢驗(yàn)法十分有必要。實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)某些雜菌已入侵部分培養(yǎng)菌，導(dǎo)致樣品無效；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，一些增稠劑自身已經(jīng)是某種微生物的代謝物，這些代謝物進(jìn)入食品，是否會(huì)威脅人體健康還需要作進(jìn)一步研究，而研究的前提則是擁有一套科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法。

在本次食品增稠劑致病菌檢驗(yàn)方法的試驗(yàn)可知，通過改變增稠劑前增菌或增菌液的樣品濃度、培養(yǎng)方式以及轉(zhuǎn)重量，可以很大地提高檢出率，采用振蕩培養(yǎng)和增容法、增加轉(zhuǎn)種量的方法，對于提高檢出率也十分有效。其中，振蕩培養(yǎng)極大地促進(jìn)增菌；增加轉(zhuǎn)種量可避免漏檢；增溶法既可以稀釋樣品濃度，又不會(huì)減少試驗(yàn)樣品的取樣量，所以試驗(yàn)樣品使用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)不會(huì)造成原理和靈敏度的改變，對檢出結(jié)果不造成影響。因此，對傳統(tǒng)檢驗(yàn)法進(jìn)行改良后，操作簡單，結(jié)果讓人滿意，該方法對黏度極高的食品增稠劑致病菌檢驗(yàn)同樣適用，最后，建議繼續(xù)完善該檢驗(yàn)法，在國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法的修訂時(shí)，將本次試驗(yàn)方式添加到相關(guān)內(nèi)容[4]，對其進(jìn)行完善；也建議相關(guān)部門新建一套專門對食品增稠劑類產(chǎn)品致病菌的檢驗(yàn)方法，提高檢驗(yàn)方法的科學(xué)合理性，為食品安全提供有效的保障。

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