郭 伶

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

犢牛大腸桿菌病又稱(chēng)犢牛白痢，是由大腸桿菌引起的一種急性傳染病，臨床以排出灰白色的稀糞、全身敗血、衰竭和脫水為主要癥狀。大腸桿菌廣泛地分布于自然界，犢牛出生后即可隨乳汁或其他食物進(jìn)入胃腸道，成為腸道的正常菌。新生犢牛當(dāng)其抵抗力降低或發(fā)生消化障礙時(shí)，均可引起發(fā)病。新生10日齡內(nèi)的奶牛犢發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的疾病，具有較高的發(fā)病率、致死率，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。犢牛大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率因有無(wú)繼發(fā)和并發(fā)感染、飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生條件、采取措施是否及時(shí)有效而差異較大［2］。2014年2～4月份，遼西某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了新生犢牛以嚴(yán)重腹瀉、脫水等臨床癥狀，發(fā)病的犢牛多為出生后1個(gè)月以?xún)?nèi)的小犢牛，有的來(lái)不及用藥即發(fā)生死亡，有的治療也無(wú)效。經(jīng)對(duì)發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品進(jìn)行致病性大腸桿菌的分離鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，為臨床合理選擇藥物，有效防治犢牛大腸桿菌病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病料采集

從遼西某發(fā)病奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集病料，將滅菌棉拭子在滅菌生理鹽水中潤(rùn)濕，在發(fā)生腹瀉犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品，置于0～4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小白鼠20只，用于致病性試驗(yàn)，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要儀器設(shè)備

顯微鏡、醫(yī)用凈化工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、手提式高壓蒸汽滅菌器等。

1.4 培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基：普通肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)、三糖鐵瓊脂斜面、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、MH培養(yǎng)基（藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基）等均按文獻(xiàn)［3］的方法制備。

生化試劑：各種糖發(fā)酵管、MR試劑、VP試劑、硝酸鹽還原試驗(yàn)用甲液和已液、檸檬酸鹽試劑、吲哚試驗(yàn)試劑、硝酸鹽、靛基質(zhì)、尿素等，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清（O1、O2、O26、O78）成都生物制品研究所（批號(hào)20130901）。藥敏紙片購(gòu)于上海醫(yī)華醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)20131008。

2 方法

2.1 涂片、染色鏡檢

將采取糞便樣品進(jìn)行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后，用顯微鏡檢查。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將采集到的糞便樣品接種于普通肉湯培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，涂片進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢。挑取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上表面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明的單個(gè)菌落，接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上，在37℃的條件下培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2.3 生化試驗(yàn)

將純培養(yǎng)菌株，移種于乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固體瓊脂、尿素瓊脂、三糖鐵和葡萄糖培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)24h，觀察在各種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)一步進(jìn)行MR、VP和吲哚試驗(yàn)。

2.4 血清型鑒定

平板凝集抗原的制備：用0.5%石碳酸緩沖鹽水2ml，將瓊脂斜面的菌落洗下，集于瓶中，121℃高壓處理2h，以破壞其k抗原。

平板凝集反應(yīng)：取一張清潔的玻片，分別將一滴O1、O2、O8、O26和 O78的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清滴至玻片上，再取等量制備好的平板凝集抗原，與玻片上的標(biāo)準(zhǔn)血清混勻，同時(shí)做生理鹽水對(duì)照。

2.5 致病性試驗(yàn)

取健康的小白鼠20只，隨機(jī)分成兩組：第一組10只，為試驗(yàn)組，皮下接種營(yíng)養(yǎng)肉湯菌液0.1mL，觀察發(fā)病情況；第二組10只，作為對(duì)照組，注射生理鹽水。觀察小白鼠發(fā)病情況，對(duì)死后的小白鼠組織進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、培養(yǎng)性狀觀察、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢查、生化鑒定等。

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)

將分離的大腸桿菌純培養(yǎng)物涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上放置5個(gè)藥敏片，置于37℃溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24h后取出，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。所用的藥敏紙片有：頭孢噻呋鈉、青霉素、鏈霉素、慶大霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺－5－甲氧嘧啶、新霉素、多粘霉素B、氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、林可霉素。

3 結(jié)果

3.1 涂片染色鏡檢結(jié)果

均可見(jiàn)兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

普通肉湯渾濁、形成菌膜、底管有少量沉淀；在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成呈圓形、光滑、不透明、中等大小、粘稠、微隆起、邊緣整齊的菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成中等大小的粉紅色菌落；在血液瓊脂平板上在呈β溶血；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大腸桿菌特有的紫黑色帶金屬光澤菌落。

3.3 生化試驗(yàn)

分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖產(chǎn)氣、產(chǎn)酸；不分解尿素，尿素酶為陰性；硫化氫反應(yīng)陰性；MR試驗(yàn)陽(yáng)性；VP試驗(yàn)陰性；三糖鐵上的反應(yīng)情況為表面黃色產(chǎn)酸，底部黃色產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫；吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。

3.4 血清型試驗(yàn)

經(jīng)血清型鑒定，在發(fā)病犢牛直腸內(nèi)采取糞便樣品中分離到的菌株為O78。

3.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

注射了肉湯純培養(yǎng)物的小白鼠均發(fā)病死亡，對(duì)照組小白鼠未見(jiàn)任何癥狀。死亡小白鼠死前精神萎靡、腹部發(fā)鉗、厭食、被毛蓬松。解剖死亡小白鼠后發(fā)現(xiàn)，肺部有出血點(diǎn)，肝臟、脾臟有不同程度的水腫，無(wú)菌采取肝臟、脾臟病料，涂片，革蘭染色、鏡檢，并進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，所得結(jié)果與糞便中分離菌相同。

3.6 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

所分離菌株對(duì)頭孢噻呋鈉、卡那霉素、氧氟沙星的高度敏感；對(duì)磺胺－5－甲氧嘧啶、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、新霉素、四環(huán)素、多粘霉素B中度敏感；對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素耐藥。

通過(guò)對(duì)發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品進(jìn)行細(xì)菌涂片、染色、鏡檢、分離培養(yǎng)、生化鑒定、致病性試驗(yàn)結(jié)果等可以確定，該牛場(chǎng)犢牛腹瀉病主要是由致病性大腸桿菌引起的細(xì)菌性腹瀉。結(jié)合藥敏試驗(yàn)，臨床可首選頭孢噻呋鈉、卡那霉素、氧氟沙星等藥物進(jìn)行治療。

4 討論

在病原菌的分離鑒定中，應(yīng)注意無(wú)菌操作，以保證分離到病原菌的純培養(yǎng)物。采集病料時(shí)，應(yīng)采取含病原菌最多的部位，以保證能順利分離到病原。待檢材料應(yīng)該放到滅菌容器中，整個(gè)取材過(guò)程要求無(wú)菌操作。能否獲得純培養(yǎng)，在很大程度上取決于分離技術(shù)。

致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的大腸桿菌毒力較強(qiáng)，使小白鼠全部死亡。本次分離到的致病性大腸桿菌經(jīng)血清型鑒定確定其血清型為O78，與東北地區(qū)流行血清型相一致。

近些年來(lái)，為了控制和預(yù)防某些細(xì)菌感染，在飼料添加劑及治療中常盲目使用一些抗菌藥物，導(dǎo)致產(chǎn)生許多耐藥菌株。大腸桿菌易產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐受性。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素敏感性較低。這可能與該場(chǎng)長(zhǎng)期或大量使用該類(lèi)藥物，使致病菌已產(chǎn)生耐藥性有關(guān)?？咕幬锏膹V泛應(yīng)用以及在疾病治療和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中超量不當(dāng)使用抗生素，使細(xì)菌對(duì)一種甚至多種常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，加之耐藥基因的傳代、轉(zhuǎn)移、傳播、擴(kuò)散，耐藥病原菌越來(lái)越多，耐藥程度越來(lái)越嚴(yán)重，形成高度和多重耐藥性，嚴(yán)重影響藥物治療效果和經(jīng)濟(jì)效益。因此建議臨床治療大腸桿菌病時(shí)，應(yīng)先分離出大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)后，再合理選擇用藥，可縮短治療時(shí)間，減少養(yǎng)殖戶(hù)的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也避免出現(xiàn)耐藥菌株。

［1］ 王明輝，劉得元.犢牛大腸埃希菌病的發(fā)病原因及防治［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2006，32（6）：112－113.

［2］ 宋冰冰，李強(qiáng).犢牛大腸桿菌病的癥狀分析及防治［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2010，（11）：42.

［3］ 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.