郭垚示 ，孫鑫序 ，張玉榮 ，樓寶 ，詹煒 ，毛國民 ，陳睿毅

（1.浙江海洋學(xué)院，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316000）

鮸魚（Miichthysmiiuy）屬鱸形目、石首魚科、鮸魚屬，是一種暖溫性底層魚類，自然分布于我國及朝鮮沿海（莊平等，2006）。它肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，系沿海常見的食用經(jīng)濟(jì)魚類。長江口是我國漁業(yè)種質(zhì)資源的寶庫，水產(chǎn)種質(zhì)資源豐富，棲息著多種名貴經(jīng)濟(jì)魚類；同時(shí)也是我國著名的漁場之一，具有豐富的漁業(yè)資源。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染等人類活動(dòng)的干擾，長江口漁業(yè)資源急劇衰退，包括鮸魚在內(nèi)的主要經(jīng)濟(jì)魚類的資源量顯著下降（李美玲等，2009）。因此，開展長江口及鄰近海域鮸魚的種質(zhì)資源及遺傳多樣性現(xiàn)狀的研究，對(duì)長江口重要漁業(yè)種質(zhì)資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用具有極其重要的意義。

海洋物種的遺傳多樣性研究不僅對(duì)種質(zhì)資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用具有重要意義，同時(shí)，還能為漁業(yè)資源的管理和監(jiān)測提供參考（Shui et al，2009）。因此，海洋物種的遺傳多樣性研究一直受到學(xué)者們的高度重視。現(xiàn)代分子生物測序技術(shù)的發(fā)展，基于基因序列測定的分子數(shù)據(jù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于魚類種群遺傳分析的各個(gè)方面（董麗娜等，2011）。線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳、進(jìn)化速度快、核苷酸替代率高等特點(diǎn)，已成為魚類進(jìn)化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究的有效工具（劉云國等，2009）。在線粒體基因組中，細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome coxidase subunitⅠ，COⅠ）序列進(jìn)化速度較快且容易擴(kuò)增，因此廣泛應(yīng)用于種群水平遺傳多樣性的檢測（孫鵬等，2011）。

目前對(duì)鮸魚的研究報(bào)道多集中于發(fā)育生物學(xué)和人工繁殖技術(shù)等方面（鐘俊生等，2005；孫慶海等，2003；李明云等，2005；樓寶，2005），關(guān)于鮸魚種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性的研究相對(duì)較少。國內(nèi)學(xué)者彭志蘭等（2010）利用AFLP分析了舟山近海野生親魚和人工繁育子一代的群體遺傳多樣性；Cheng等（2011）利用線粒體控制區(qū)分析了浙江海域6個(gè)鮸魚群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀；夏月恒等（2013）利用Cytb初步分析了我國近海38尾鮸魚的遺傳多樣性。長江口及鄰近海域是鮸魚重要的產(chǎn)卵場和棲息地，本研究利用COⅠ基因序列片段對(duì)長江口及鄰近海域鮸魚群體遺傳變異進(jìn)行分析，以期為長江口及鄰近海域鮸魚資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)的參考依據(jù)，并為將來其遺傳育種與良種選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實(shí)驗(yàn)用鮸魚樣品共60尾，于2011年分別采集自崇明 （31°81′N， 121°65′E，數(shù)量 30 尾，全長為 23.62～28.78 cm，體重為 157～262 g）和舟山（30°08′N，122°30′E， 數(shù)量 30 尾，全長為 19.72～25.78 cm，體重為107～232 g）沿海 （圖1），經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定后取其尾鰭保存于95%乙醇中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后保存，用于基因組DNA的提取。

圖1 鮸魚樣本采集分布圖

1.2 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測序

基因組DNA采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提?。═IANGEN，北京）。COⅠ序列的擴(kuò)增參照Sun等（2012）的方法進(jìn)行，稍加修改。擴(kuò)增引物COⅠ-F（5’-TCA ACCAACCACAAA GAC ATT GGC AC-3’）和 COⅠ-R （5’-TAG ACT TCTGGG TGG CCA AAG AATCA-3’），由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中包含模板 DNA 400 ng，10×PCR buffer 5μL，25mmoLMg2+4μL，2.5mmoL dNTPs 4μL，Taq DNA聚合酶 （Takara）1U，10mM的上、下游引物各2μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性45 s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠純化試劑盒回收（TIANGEN，北京）PCR產(chǎn)物，純化后測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 BioEdit7.0（Halletal， 2009）對(duì)DNA 序列進(jìn)行編輯和人工核查；利用Clustal X 1.83（Thompson etal，1997）軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)；DNA序列的堿基組成、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（S）、單倍型數(shù)（N）、核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多樣性（Hd）等遺傳多樣性參數(shù)用MEGA 4.0（Tamura et al， 2007）和 DNASP 5.0 （Rozas etal， 2003）軟件進(jìn)行計(jì)算分析；在Arlequin3.1（Exoffier et al，2008）軟件中進(jìn)行AMOVA分析，計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)（F-statistics，F(xiàn)ST），檢驗(yàn)其顯著性水平（重復(fù)次數(shù)1 000），由公式Nm=（1-FST）/2 FST計(jì)算群體間的基因流Nm。通過中性檢驗(yàn)分析鮸魚的群體歷史動(dòng)態(tài)，采用Arlequin軟件計(jì)算Tajima’D，F(xiàn)u and Li’F，F(xiàn)u and Li’D，以及 Fu’s Fs統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)值，以檢驗(yàn)群體是否顯著偏離中性進(jìn)化（Rozaset al， 2003； Exoffier etal， 2008）。

2 結(jié)果

2.1 線粒體COⅠ基因片段的序列分析結(jié)果

將所測得序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，確定為鮸魚線粒體的COⅠ基因部分序列。序列經(jīng)比對(duì)分析后剪輯對(duì)齊，得到長度為599 bp的COⅠ基因片段。在所測的60條序列中，A、T、G、C堿基的平均含量分別為22.9%、26.9%、20.0%和30.2%。A+T的含量為49.8%，G+C的含量為50.2%，G+C的含量略高于A+T的含量（表1）。在密碼子第一位，G和C的含量為53%；在密碼子第2位，T的含量最高，為41%；而在密碼子第3位，C含量最高，占總堿基數(shù)的46.7%，而G含量最低，只有10.6%。

表1 鮸魚兩個(gè)群體COⅠ基因片段堿基組成

2.2 單倍型分布及群體的多樣性指數(shù)

對(duì)2個(gè)群體共60尾鮸魚的COⅠ基因序列進(jìn)行分析，共定義20種單倍型，存在22個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，產(chǎn)生23個(gè)突變。在所有的多態(tài)性位點(diǎn)中，簡約信息位點(diǎn)（I）有7個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的1.2%；單一位點(diǎn)15個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的2.5%；平均轉(zhuǎn)換與顛換比（Ti/Tv）為3.61，沒有發(fā)現(xiàn)插入或缺失現(xiàn)象（表2）。Hap3、Hap11和Hap19為共享單倍型，分別包括3個(gè)、4個(gè)和34個(gè)個(gè)體，其余17個(gè)單倍型為單一群體獨(dú)享。兩群體的平均單倍型多樣性（Hd）為0.676 8，核苷酸多樣性（Pi）為 0.002 29，平均堿基差異（K）為1.374。各個(gè)群體的遺傳多樣性見表2，其中舟山群體的遺傳多樣性指數(shù)（Hd=0.749 4±0.08 4，Pi=0.002 38±0.000 51）均略高于崇明群體（Hd=0.602±0.104，Pi=0.002 18±0.000 52）。

表2 鮸魚兩個(gè)群體遺傳多樣性參數(shù)

表3 鮸魚群體分子方差分析結(jié)果

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)分析

利用Arlequin3.1軟件估算2個(gè)群體間的分化指數(shù)（FST）和基因交流值（Nm），結(jié)果表明崇明和舟山群體間有較高的基因交流值（Nm≈56），無明顯的遺傳分化 （FST=0.008 83，P＞0.05）（表3）。采用鄰接法（NJ）構(gòu)建的20個(gè)單倍型的分子系統(tǒng)樹如圖2所示。所有的單倍型被分成兩個(gè)分支。NJ樹的上側(cè)分支中，14個(gè)單倍型聚為一支，其余6個(gè)單倍型構(gòu)成另一支。中性檢驗(yàn)Tajima′s D和Fu′s Fs結(jié)果如表4所示，2個(gè)群體的檢驗(yàn)值均為負(fù)值且差異顯著（P＜0.05），顯示兩群體經(jīng)歷群體擴(kuò)張事件。

圖2 基于鮸魚COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

表4 鮸魚群體的中性檢驗(yàn)分析

3 討論

3.1 單倍型及群體遺傳多樣性

本研究中，鮸魚2個(gè)群體60個(gè)樣本中，共檢出22個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，定義了20個(gè)單倍型，其中Hap3、Hap11和Hap19為2個(gè)群體所共有，其中具有Hap19的個(gè)體數(shù)為34個(gè)，占總數(shù)的56.7%。推測Hap19很可能是較原始的單倍型類型，其他單倍型可能由此單倍型演變而來（圖3）。長江口兩個(gè)鮸魚群體的平均單倍型多樣性指數(shù)為0.677，平均核苷酸多樣性為0.002 29，呈現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性水平。本研究的鮸魚遺傳多樣性參數(shù)比Cheng等（2011）利用線粒體控制區(qū)分析的浙江海域6個(gè)鮸魚群體的遺傳多樣性指數(shù)低（Hd=0.9933，Pi=0.0097）低，較之夏月恒等（2013）利用Cytb對(duì)黃海和東海的38尾鮸魚遺傳多樣性的分析結(jié)果（Hd=0.960±0.020，Pi=0.002 71±0.000 30）也要低。分析其原因，可能是線粒體基因組不同編碼區(qū)域的遺傳變異速率不同有關(guān)，線粒體的COⅠ基因序列的變異速率要比Cytb和控制區(qū)的變異速率低引起的（Sbisàetal，1997）。

圖3 鮸魚單倍型中介連接網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（崇明（白），舟山（黑））

Grant等（1998）根據(jù)群體的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）和核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）將海水魚類大致分為4種類型：第一種類型是低的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性 （Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二種類型是高的單倍型多樣性與低的核苷酸多樣性；第三種類型是低的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性；第四種類型是高的單倍型多樣性與高的核苷酸多樣性。鮸魚具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，應(yīng)屬第二種類型。這種遺傳多樣性模式在其他海水魚類中如大瀧六線魚、銀鯧、花鱸和松江鱸等也廣泛存在（Habib et al，2011；彭士明 等，2009；Liu et al，2006；高天翔等，2013）。該類型表明鮸魚種群可能處于瓶頸效應(yīng)后的增長與突變積累時(shí)期，即鮸魚可能是由一個(gè)小的種群經(jīng)過擴(kuò)張形成，快速的種群增長有利于單倍型多樣性的增加，但沒有足夠的時(shí)間積累核苷酸的變異，因此導(dǎo)致了單倍型多樣性指數(shù)較高而核苷酸多樣性指數(shù)較低的遺傳多樣性模式（Bowen et al，2001）。中性檢驗(yàn)結(jié)果表明所研究的鮸魚群體經(jīng)歷過選擇和顯著擴(kuò)張。單倍型中介連接網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖大致呈星狀放射結(jié)構(gòu)（圖3），也提示種群所經(jīng)歷的擴(kuò)張歷史 （Cheng et al， 2011；Liu et al，2006）。

3.2 群體遺傳分化和基因流

一般而言，海洋魚類由于具有較大有效群體數(shù)量和遷移擴(kuò)散能力而存在廣泛的基因流和較低的遺傳分化水平（Beheregaray etal，2001）。遺傳分化系數(shù)FST是用來測量群體之間遺傳分化的重要指標(biāo)，在0到1的范圍內(nèi)，F(xiàn)ST值越大，兩種群的分化程度越高（楊金權(quán)等，2008）。本研究中，分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，遺傳變異主要來自群體內(nèi)（99.12%），而群體間較小的遺傳分化系數(shù)較?。‵ST=0.008 83，P＞0.05），表明這兩個(gè)群體間無顯著遺傳分化。本研究結(jié)果與Cheng等（2011）和夏月恒等（2013）的研究結(jié)果基本一致。夏月恒等通過Cytb發(fā)現(xiàn)我國近海3個(gè)地點(diǎn)的鮸魚群體未出現(xiàn)明顯遺傳分化，Cheng等分析浙江海域6個(gè)地理群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)僅存在微弱的遺傳分化?；蛄飨禂?shù)Nm反映種群之間的交流情況，當(dāng)Nm＜1時(shí)，種群之間處于隔離狀態(tài)；Nm＞1時(shí)，表明種群間存在一定的基因流動(dòng)；當(dāng)Nm＞4時(shí)，表明各群體為一個(gè)大的隨機(jī)單元（Masatoshietal，2000）。本次研究得到的基因流系數(shù)Nm≈56，表明舟山跟崇明群體為一個(gè)大的隨機(jī)單元。用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)樹和利用Network構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖均顯示不同地理來源的單倍型交錯(cuò)分布，沒有明顯的地理群聚和譜系結(jié)構(gòu)。究其原因，一方面可能是由于舟山和崇明兩個(gè)群體的地理間隔較?。涣硪环矫嬗捎陂L江口是鮸魚重要產(chǎn)卵區(qū)，其生殖期由深水向近岸作洄游形成隨機(jī)交配的群體；從而導(dǎo)致兩個(gè)群體間具有廣泛的基因交流，遺傳同質(zhì)性程度較高（莊平等，2006）。

群體遺傳結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)行某一群體長期的可持續(xù)保護(hù)和管理的重要組成部分，物種遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)，遺傳變異是有機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化的必要條件（Yang etal，2007）。本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體遺傳多樣性水平相對(duì)較低，推測其可能是由于捕撈壓力和環(huán)境惡化導(dǎo)致鮸魚補(bǔ)充群體逐年減少、資源量下降，進(jìn)而引起有效群體的數(shù)量、大小迅速下降，出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)，從而最終導(dǎo)致了群體遺傳多樣性水平的下降。同時(shí)，由于本研究僅采用了COⅠ分子標(biāo)記以及分析的種群數(shù)量有限，可能未全面反映鮸魚的遺傳結(jié)構(gòu)，因此下一步研究需要結(jié)合多個(gè)分子標(biāo)記手段并增加采樣范圍，以期對(duì)鮸魚遺傳多樣性水平、種群歷史進(jìn)行更深入的分析，從而更加準(zhǔn)確評(píng)估其有效種群大小，制定和采取合理的保護(hù)和管理措施。

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