任召磊

0 引言

肝癌是侵入性肝臟的惡性腫瘤之一，且多見于原發(fā)性肝癌[1]。當(dāng)前我國肝癌發(fā)病率居高，已嚴(yán)重威脅到人民健康和生命安全，造成了沉重的社會負(fù)擔(dān)，其誘發(fā)的并發(fā)癥也難以控制[2]。目前，臨床上多采用手術(shù)切除腫瘤組織，達到清除腫瘤細(xì)胞的效果，但其突顯的風(fēng)險高，費用高，預(yù)后差等特性也限制了它的推廣[3]。而化學(xué)治療是治療腫瘤等疾病的主要手段之一，氟尿嘧啶對多種腫瘤如肝癌等有一定療效，故在臨床上得到廣泛應(yīng)用[4]。在當(dāng)前的實驗中，我們擬采用體外建立穩(wěn)定人肝癌HepG-2細(xì)胞株，以細(xì)胞凋亡為研究對象，研究氟尿嘧啶的抗肝癌作用與促凋亡相關(guān)通路關(guān)系，為闡明其誘導(dǎo)HepG-2凋亡的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG-2細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院科學(xué)實驗室惠贈。

1.1.2 藥物與試劑 氟尿嘧啶(純度>99.0%)：Spectrum公司。DMEM培養(yǎng)基：Life Technologies公司。胎牛血清：上海微科生化試劑有限公司。胰蛋白酶：Life Technologies公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)：上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。DAPI染色試劑盒：北京中生瑞泰科技有限公司。Fas和cleaved-caspase-8抗體：Life Technologies公司。蛋白裂解液：武漢博士德生物工程有限公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：Life Technologies公司。

1.1.3 儀器HettCube 200二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Hettich公司)。XYH-3A倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。HD-650超凈工作臺(上海皓莊儀器有限公司)。Biorad GelDoc XR伯樂凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。SHP-250(D)恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下，BD培養(yǎng)基中加入新配置10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素，低溫保存待用。HepG-2細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，移植到培養(yǎng)瓶中，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵化(37 ℃，5% CO2)。PBS緩存液沖洗5次，加入8 mL 0.2%的胰蛋白酶液，置37 ℃消化15 min。隨后，細(xì)胞懸浮液移入無菌刻度離心管中，低速離心15 min后再次消化5次，然后進行MTT實驗操作。

1.2.2 分組及給藥 精密稱取200 μg氟尿嘧啶，用含10%胎牛血清的BD培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的5-Fu(0、40、80、160 μM)，每孔120 μL，同時設(shè)8個平行孔/組，重復(fù)實驗10次，取平均值。應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件計算IC50(半數(shù)抑制率)，同時建立對照組。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

1.3 指標(biāo)檢測 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定5-Fu對HepG-2的抑制作用，DAPI染色檢查細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，Western blot法測定內(nèi)源性Fas蛋白以及cleaved-caspase-8表達水平。

P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu干預(yù)抑制HepG-2增殖 MTT法實驗數(shù)據(jù)表明，梯度濃度5-Fu抑制HepG-2的增殖活力明顯增強，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而且，隨著時間的增加5-Fu的抑制作用逐漸增加，體現(xiàn)一定的時間-劑量依賴性。見圖1。

圖1 5-Fu干預(yù)對HepG-2抑制增殖的作用

2.2 5-Fu干預(yù)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞核裂變 DAPI染色結(jié)果顯示，空白對照組中HepG-2的細(xì)胞排列均勻，組織形態(tài)整齊完整，胞核漿清晰，細(xì)胞增殖分化旺盛。40 μM 5-Fu干預(yù)72 h后，部分肝癌細(xì)胞體積收縮，細(xì)胞質(zhì)變性明顯，核破裂，表現(xiàn)細(xì)胞凋亡。同時，在80和160 μM 5-Fu干預(yù)后，HepG-2核染凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡形態(tài)改變明顯，核裂解溶解，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。見圖2。

圖2 5-Fu干預(yù)后對HepG-2細(xì)胞組織形態(tài)的影響(DAPI染色，×200)

2.3 5-Fu干預(yù)上調(diào)HepG-2內(nèi)源性Fas、cleaved-caspase-8表達 Western blotting分析數(shù)據(jù)表明，空白對照組HepG-2細(xì)胞內(nèi)源性Fas、cleaved-caspase-8表達較少，基本維持在低生理水平狀態(tài)。而在5-Fu干預(yù)后，HepG-2細(xì)胞Fas蛋白和cleaved-caspase-8表達水平顯著增加，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表現(xiàn)為一定的時間-劑量依賴性。見圖3。

圖3 5-Fu干預(yù)后對HepG-2細(xì)胞Fas蛋白和cleaved-caspase-8表達水平的影響

3 討論

肝癌是一種嚴(yán)重威脅全球公眾健康的疾病之一，且患者生存率低[5]。因此，鑒定具有更好的效力和較低的毒性的抗肝癌藥物是迫切需求的科學(xué)攻關(guān)[6]。在當(dāng)前實驗中，MTT法數(shù)據(jù)顯示，正常情況下HepG-2細(xì)胞增殖分化能力強，提示抑制癌癥細(xì)胞過度增殖是治療肝癌的有效手段。5-Fu干預(yù)后能有效控制HepG-2增殖分化，表明5-Fu發(fā)揮有效的抑制肝癌細(xì)胞增殖活性。而且，DAPI染色形態(tài)檢查進一步顯示，5-Fu可以介導(dǎo)HepG-2細(xì)胞核裂變，即發(fā)生細(xì)胞凋亡，其實驗結(jié)果與MTT結(jié)果一致。

研究表明，細(xì)胞內(nèi)Fas元件耦合其配體FasL介導(dǎo)細(xì)胞的殺傷作用，其機制為通過穿孔素和顆粒酶相互作用的結(jié)果。穿孔素在大量的Ca2+微環(huán)境中直接作用在靶細(xì)胞膜，并經(jīng)多聚反應(yīng)形成管狀結(jié)構(gòu)，直接插入并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，同時顆粒酶轉(zhuǎn)移至胞漿，直接招募活化胞漿中系列蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡[7-8]。半胱氨酸蛋白酶caspase-8因具有FADD樣結(jié)構(gòu)域，而且與DED結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而將細(xì)胞膜外信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞漿內(nèi)在聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞膜表面的Fas與其配體FasL多聚化而激活時，觸發(fā)FADD與受體胞漿區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域互相結(jié)合，胞漿中變構(gòu)后(剪切)caspase-8，使下游蛋白酶發(fā)生逐級活化，從而啟動細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)的細(xì)胞凋亡進程[9-10]。因此，癌細(xì)胞內(nèi)源性Fas/caspase-8通路是抗腫瘤藥物開發(fā)的潛在靶點。本實驗Western blotting結(jié)果表明，HepG-2細(xì)胞內(nèi)源性Fas蛋白和cleaved-caspase-8水平顯著減少。在5-Fu干預(yù)后，HepG-2細(xì)胞中Fas蛋白和cleaved-caspase-8水平有效地上調(diào)，表明5-Fu特異性激活Fas蛋白活性，從而增強caspase-8剪切水平，進而啟動系列程序誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們推測5-Fu介導(dǎo)的抗肝癌作用與其激活HepG-2內(nèi)源性Fas信號通路有關(guān)，并將為其今后的臨床應(yīng)用提供科學(xué)理論支持。

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