梁亮 何紅華 蔡靜怡 林斌

纖溶功能下降是多種血栓性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一,纖溶酶原激活劑抑制物-1主要生理功能為抑制組織型纖溶酶激活物和尿激酶型纖溶酶激活物的活性,是參與調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的平衡的重要組成部分,而纖溶活性的平衡是防止血栓形成的重要保護(hù)機(jī)制。目前研究發(fā)現(xiàn),血漿PAI-1水平受多種環(huán)境因素及遺傳因素影響,其中PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)的某些功能性單核苷酸多態(tài)性如4G/5G、-844G/A與血漿PAI-1水平的增高有關(guān)。但PAI-1基因單核甘酸多態(tài)性與缺血性心腦血管疾病在不同地區(qū),人群及種族的研究結(jié)果不一致,一直存在爭(zhēng)議。本研究初步探討了位于PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的4G/5G、-844G/A單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)發(fā)病的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有對(duì)象來(lái)自廣東粵西地區(qū)漢族人。其中病例組系2002年8月～2003年8月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的72 h發(fā)病的初治缺血性腦卒中患者共130例,為病例組,男78例,女52例,平均年齡(64.81±8.87)歲。所有病例均符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組：隨機(jī)選擇同期健康體檢者,均排除心、腦血管疾病,無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂及遺傳疾病史,共112例,對(duì)照組男67例,女45例,平均年齡(63.05±7.06)歲。

1.2 方法 缺血性腦卒中患者(發(fā)病后,治療前)及正常對(duì)照組個(gè)體于清晨空腹、臥位采集肘靜脈血5 ml,以3.8%枸櫞酸鈉1：9抗凝,室溫下離心分離血漿置于- 80℃保存,酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血漿PAI-1水平。

1.3 采用鹽抽提法[1],稍作改良以從白細(xì)胞中抽提基因組DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)引物序列,序列及酶解片段見(jiàn)表1 (引物由上海工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。擴(kuò)增體系如下：總反應(yīng)體積25 μl,含待測(cè)基因組DNA 0.2 μg,dNTP 0.2 mmol/L,MgCl21.5～2.5 mmol/L,10×buffer 2.5 μl,Taq酶0.75 U,上下游引物各42 μmol/L,擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性7 min,94℃變性55 s,退火條件見(jiàn)表1,72℃50 s,循環(huán)32次。

1.5 酶切PCR產(chǎn)物及電泳分析 取-844G/A位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物15 μl,加入限制內(nèi)切酶Xho I 5 U及相應(yīng)酶切緩沖液37℃水浴過(guò)夜。將4G/5G位點(diǎn) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及-844G/A位點(diǎn)酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳,用溴化乙錠染色,紫外線燈照射下觀察并照相。根據(jù)電泳圖譜確定基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料輸入Microsoft Excel 97中建立數(shù)據(jù)庫(kù),并運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。應(yīng)用基因記數(shù)方法計(jì)算出相對(duì)等位基因頻率。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用t檢驗(yàn),基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度采用χ2檢驗(yàn)。采用EH+軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析及單倍型分析。多態(tài)性位點(diǎn)與缺血性腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性用比值比(odds ratios,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組及對(duì)照組臨床資料比較 見(jiàn)表2。兩組樣本中的性別比例、年齡、總膽固醇、甘油三脂、血糖水平等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而血壓(收縮壓和舒張壓)和血漿PAI-1水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 病例組及對(duì)照組中4G/5G、-844G/A多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布均符合Hard-Weinberg平衡,均具有群體代表性。病例組和對(duì)照組之間兩個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 單倍型分析 PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性所構(gòu)建的單倍型有4種,見(jiàn)表4。單倍型分析結(jié)果顯示4G-A-844在病例組的頻率較高,與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而5G-G-844在對(duì)照組的分布頻率高于病例組(P＜0.01)。

表1 PAI-1基因性4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)的引物序列、退火條件、擴(kuò)增片段、基因型及酶切片段長(zhǎng)度

表2 缺血性腦卒中與對(duì)照組臨床資料比較(±s)

表2 缺血性腦卒中與對(duì)照組臨床資料比較(±s)

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=112) 病例組 (n=130) P性別(男/女) 67/45 78/52 NS年齡(歲) 63.05±7.06 64.81±8.87 NS甘油三脂(mmol/L) 1.605±0.601 2.204±1.072 NS膽固醇(mmol/L) 5.191±0.887 4.959±1.034 NS收縮壓(mm Hg) 118.3±18.4 148.8±26.4 0.01舒張壓(mm Hg) 73.6±9.7 86.5±11.7 0.01空腹血糖(mmol/L) 5.306±0.699 5.993±1.786 NS血漿PAI-1水平(ng/ml) 23±14 36±15 0.01

表3 病例組和對(duì)照組PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較(±s)

表3 病例組和對(duì)照組PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較(±s)

0.6577 0.3423 1.789 1.341～2.386對(duì)照組 112 26(23.2) 0.5117 0.4883 P＜0.01-844G/A GG GA+AA G A病例組 130 31(23.8) 75(57.7)+24(18.5)52(46.4)+13(11.6)組別 例數(shù) 基因型(%) 等位基因 比值比(OR) 95%可信區(qū)間(CI)4G/5G 4G4G 4G5G+5G5G 4G 5G病例組 130 61(46.9) 49(37.7)+20(15.4)64(57.1)+22(19.4)0.5270 0.4730 1.681 1.299～2.173對(duì)照組 112 47(42.0) 0.6518 0.3482 P＜0.05

表4 病例組和對(duì)照組的PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性所構(gòu)建的單倍型比較

3 討論

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PAI- 1基因4G/5G多態(tài)性位點(diǎn)的5G等位基因與 4G等位基因相比,在 PAI- 1啟動(dòng)子區(qū)插入了 1 個(gè)堿基而創(chuàng)造了一個(gè)核蛋白(因子B)的結(jié)合位點(diǎn),此蛋白可行使轉(zhuǎn)錄抑制作用。而4G位點(diǎn)只結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,具有較高的PAI-1基因轉(zhuǎn)錄速率,且4G/4G純合子型者的細(xì)胞有較高的 PAI- 1 分泌功能和血漿較高 PAI- 1水平。PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)的另一個(gè)單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)-844G/A位于潛在的Ets蛋白DNA的限制序列,能影響PAI-1基因的轉(zhuǎn)錄[3]。提示血漿 PAI-1 水平和 PAI-1 基因啟動(dòng)子區(qū)4G/ 5G、-844G/A等功能性位點(diǎn)之間有直接關(guān)系。高水平的PAI-1可以抑制t-PA ,導(dǎo)致纖溶活性降低,參與血栓的形成; 同時(shí)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈壁增厚,故易于導(dǎo)致缺血性腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生。近年來(lái)的病例對(duì)照研究結(jié)果表明PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)與IS的發(fā)病密切相關(guān),是IS的重要危險(xiǎn)因子之一,可增加IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4,5]。然而,亦有部分研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)PAI-1基因多態(tài)性與IS關(guān)聯(lián)。

本文研究結(jié)果顯示,在IS組中,以4G/5G位點(diǎn)的4G4G基因型個(gè)體為多,其分布頻率最高(0.469),4G等位基因的頻率為0.6577。而正常對(duì)照組4G/5G位點(diǎn)4G4G基因型相對(duì)較低(0.232),4G、5G等位基因的頻率分別為0.5117、0.4883,與病例組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。對(duì)照組-844G/A位點(diǎn)的野生型GG、雜合子GA、純合子AA的頻率分別為0.420、0.464、0.116。與對(duì)照組比較,IS組GG基因型分布頻率明顯降低(0.238),A-844等位基因頻率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 上述研究結(jié)果說(shuō)明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS 關(guān)聯(lián),4G/5G 的4G、A-844等位基因的攜帶者比非攜帶者患IS的相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)分別大1.789倍、1.681倍。本文的研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)Shaoyong Su等人報(bào)道相似,通過(guò)一組病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn),在非吸煙人群中,4G/5G位點(diǎn)的4G等位基因、-844G/A位點(diǎn)的A等位基因與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性毗鄰,均位于PAI-I基因啟動(dòng)子區(qū)域。通常認(rèn)為相距較近的位點(diǎn)連鎖不平衡程度較緊密。Kathiresan等的研究認(rèn)為由于4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性之間存在緊密連鎖不平衡關(guān)系,故不易判斷哪個(gè)位點(diǎn)通過(guò)影響血漿PAI-1水平而導(dǎo)致缺血性心腦血管疾病的發(fā)生。因此,為了進(jìn)一步了解兩個(gè)位點(diǎn)與IS 的關(guān)系,作者構(gòu)建了兩個(gè)位點(diǎn)的單倍型,發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組之間4G-A-844和5G-G-844單倍型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組中5G-G-844的頻率明顯高于病例組(P＜0.01),表明該單倍型與降低IS 的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián),可能是保護(hù)性單倍型,而病例組中4G-A-844的頻率高于對(duì)照組(P＜0.01),提示該單倍型與IS的易感性關(guān)聯(lián),攜帶單倍型4G-A-844可能會(huì)增加患IS的風(fēng)險(xiǎn)。

總之,本研究中分析了廣東粵西地區(qū)PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性在IS患者中的分布頻率差異,并研究與疾病發(fā)生危險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果表明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS 密切關(guān)聯(lián),4G/5G 的4G、A-844等位基因可以增加患IS 的危險(xiǎn)性,單倍型4G-A-844可能為IS的遺傳易感因素。上述研究結(jié)果將為缺血性腦卒中的一、二級(jí)預(yù)防提供一定的線索及理論依據(jù)。

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