馬振華 鄒春燕

幽門螺桿菌(HP)感染在慢性活動性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等各種胃腸道疾病中是一個至關重要的致病因素[1]。目前,我國是HP感染率及胃癌的發(fā)病率最高的國家[2]。根據(jù)cag致病島的有無,將HP分為I型和II型,I型包含cag致病島[3]。I型比II型更易誘導細胞形態(tài)的改變及更嚴重的炎癥反應[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS細胞24 h,48 h,通過ELISA檢測IL-17的濃度,進而討論HP不同分型對IL-17的誘導作用及機制。

1 資料與方法

1.1 AGS細胞的培養(yǎng) 將AGS細胞(購買于中國科學院上海細胞研究所)接種至培養(yǎng)皿,加入RPMI1640培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。

1.2 HP的培養(yǎng) 在微需氧環(huán)境下,HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株(美國ATCC公司)用哥倫比亞血瓊脂選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 HP不同菌株感染AGS細胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株處于對數(shù)生長期時,分別取少許菌液涂片,用PBS溶液將處于對數(shù)生長期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分別清洗2遍,5000轉(zhuǎn),離心5 min；分別制備HP懸液。

AGS細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的80%時,棄掉原培養(yǎng)基,按細菌：細胞=100：1比例加入HP懸液,放入37℃、5%CO2孵育箱共同培養(yǎng)24 h、48 h。

1.4 ELISA

1.4.1 ELISA檢測IL-17濃度 IL-17酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購買自南京奧尼多福公司,取出上述不同菌株感染的AGS細胞,3000轉(zhuǎn),離心20 min。收集細胞上清,ELISA檢測IL-17濃度。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4.2 待測樣品濃度的計算 以OD值為縱坐標,濃度為橫坐標,做出標準曲線并求出曲線方程,然后根據(jù)待測樣品的OD值在該曲線上求出相應的IL-17濃度,再乘以稀釋倍數(shù)5倍,即待測樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗,計數(shù)資料用率(%)表示,采用χ2檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用Bartlett檢驗對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。若方差齊,兩個樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗。若方差不齊,則采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HP不同亞型菌株感染AGS細胞24 h、48 h后誘導IL-17的表達與空白對照組比較 HP I型與II型分別感染AGS細胞24 h、48 h后較空白對照組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

表1 HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17 濃度的比較(±s)

注：與空白對照組相比,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h空白對照組 10.01±3.4 10.00±3.2 HP26695感染組 102.17±2.20a 105.87±7.00a HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.2 HP不同亞型菌株誘導IL-17的表達 24 h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；48h時HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導IL-17濃度的比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；結(jié)果提示HP I型HPK5菌株誘導AGS細胞產(chǎn)生IL-17濃度大。見表2。

表2 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

表2 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 HP26695 相比 ,aP＜0.05

不同菌株 24 h 48 h HP26695感染組 102.17±2.20 105.87±7.00 HPK5感染組 124.68±3.32a 126.49±13.45a

2.3 HP同一亞型菌株感AGS細胞24 h、48 h后IL-17的表達 I型HP感染AGS細胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); II型HP感染AGS細胞24 h、48 h后,IL-17濃度表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

表3 HP感染AGS細胞各時間段IL-17 濃度的比較(±s)

注：與 24 h 相比 ,aP＞0.05

不同菌株 HP26695感染組 HPK5感染組24 h 102.17±2.20 124.68±3.32 48 h 105.87±7.00a 126.49±13.45a

3 討論

IL-17是重要的促炎性細胞因子,其可誘導多種細胞釋放炎癥介質(zhì),IL-17不僅與炎性反應密切相關,亦與自身免疫性疾病、消化道惡性腫瘤等相關［5］。研究表明,IL-17廣泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤中。IL-17具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,并可作用于腫瘤細胞及成纖維細胞等［6］。同時,亦發(fā)現(xiàn)腫瘤所處的微環(huán)境可直接誘導IL-17細胞因子。IL-17可通過CXCL8因子促進中性粒細胞聚集,此外,中性粒細胞亦可通過CCL2和CCL20因子促進IL-17的產(chǎn)生。IL-17可以通過上調(diào)腫瘤細胞及基質(zhì)細胞IL-6的表達量,IL-6作用于STAT3途徑,從而激活促癌基因的產(chǎn)生,發(fā)揮延長細胞周期、抗凋亡、促進腫瘤血管生成［7］。

本研究結(jié)果顯示HP不同亞型感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達量均較空白對照組表達量明顯升高,這與蘇濤［8］等研究一致,實驗結(jié)果提示HP可誘導IL-17濃度表達,從而加重炎癥反應。本研究結(jié)果亦顯示,I型HP感染AGS細胞后產(chǎn)生IL-17濃度大。此外,大多數(shù)學者認為IL-17隨腫瘤進展而增加,且IL-17水平與腫瘤TNM分期正相關［9］,但本實驗結(jié)果示I型和II型HP均感染AGS細胞24 h、48 h后IL-17濃度表達無明顯差異,這與上述觀點相悖,有待進一步研究探討,明確是否隨著時間的推移,IL-17濃度變化呈升高趨勢。

綜上所述,在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中,HP不同亞型菌株感染后所誘導IL-17的表達各不相同,尤其I型HP是誘導IL-17濃度表達的重要因素,充分探討IL-17在胃癌中的作用及HP不同亞型誘導IL-17濃度表達的作用機制,使IL-17可作為潛在治療靶點,以期為臨床治療與診斷提供新的思路。

[1]Kusters JG,van Vliet AH,Kuipers EJ.Pathogenesis of Helicobacter pylori infection.Clinic Microbiology Rev,2006,19(4):449-490.

[2]Zhu YL,Zheng S,Du Q,et al.Characterization of Cag A variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients.World J Gastroenterol,2005,11(8):880-884.

[3]Covacci A,Rappuoli R.Helieobacter pylori：after the genomes,back to biology.J Exp Med,2003,197(1):807.

[4]Correa P,Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome:Implications for Gastric carcinogenesis”.Cut Liver,2012,6(1):21-28.

[5]Sux,Ye J,Hsueh EC,et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells.J Immunol ,2010(184):1630-1641.

[6]Kuang DM,Peng C,Zhao Q,et al.Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells.Hepatology,2010,51(1):154-164.

[7]Pelletier M,Maggi Li,Micheletti A,et al.Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells.Blood,2010,45(115)335-343.

[8]蘇濤.IL-17 在胃癌組織中的表達及臨床意義.第四軍醫(yī)大學,2009.

[9]Maruyama T,Kono K,Mizukami Y,et al.Distribution of Th17 cells and FoxP3(+) regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes,tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer.Cancer Science,2010,8(101):1947-1954.