呂 陽

(中國疾病預(yù)防控制中心設(shè)備處，北京 102206)

1 悉生生物學(xué)與無菌隔離的概念

人和動物的體內(nèi)通常會棲息著一些微生物。這些微生物群和寄主的關(guān)系以及它們彼此之間的關(guān)系十分復(fù)雜。無菌動物的出現(xiàn)，使人們研究動物體與單一細菌的關(guān)系成為可能?？茖W(xué)家也可以研究某兩個細菌之間的協(xié)同或者拮抗作用。如果某一生物體中沒有任何可檢出的其他生物，或者除少數(shù)棲息其中的已知生物外，不能再檢出其他生物，則這一生物體和棲息其中的已知生物之間的關(guān)系，無論是互利的或有害的，均形成一種悉生態(tài)。此時這一悉生態(tài)中的生物即為悉生生物。研究悉生生物以及由悉生生物構(gòu)成的悉生態(tài)的生物學(xué)分支學(xué)科稱為悉生生物學(xué)。

利用悉生動物開展微生物學(xué)研究，可排除動物體內(nèi)不明微生物對實驗結(jié)果的干擾，實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性得到明顯的很高。實踐證明，要獲取無菌動物或悉生動物，就必須解決無菌隔離技術(shù)。建立在無菌隔離技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的無菌動物、單菌動物、雙菌動物、多菌動物和特殊病原體動物總稱為悉生動物，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品工業(yè)微生物研究等不同領(lǐng)域，并取得了普通動物實驗所無法實現(xiàn)的豐碩成果。

2 無菌隔離技術(shù)的發(fā)展

2.1 傳統(tǒng)潔凈室技術(shù)

傳統(tǒng)的潔凈室將操作人員、操作環(huán)境和操作對象混在一個空間，很容易導(dǎo)致細菌污染，甚至導(dǎo)致活性物質(zhì)的特性喪失。同時，傳統(tǒng)的潔凈室無法保證人員在操作高毒性物質(zhì)過程中的安全，也無法保證環(huán)境不被污染。另外，傳統(tǒng)的潔凈室還存在長期運行維護成本高、風(fēng)險大、驗證困難等問題。

2.2 限制進出屏障系統(tǒng)(RABS)

是繼傳統(tǒng)的潔凈室技術(shù)后較早興起的一種無菌隔離技術(shù)。美國FDA對RABS的定義為“A physical partition that affords aseptic processing area(ISO5)protection by partially separating it from the surrounding area”，即通過一個物理的隔斷將無菌操作區(qū)域(A級)與周圍環(huán)境(B級)隔離開，以給無菌操作區(qū)域提供保護[1]。RABS將操作過程中要求的A級環(huán)境與周圍B級環(huán)境采用物理屏障隔開，減少了不同潔凈級別之間、操作人員與A級環(huán)境之間的交叉污染(圖1)。

圖1 RABS示意圖

根據(jù)配備高效過濾器的方法不同，RABS可以分為被動式RABS和主動式RABS。其主要區(qū)別在于，被動式RABS的A級環(huán)境與周圍B級環(huán)境的潔凈室共用高效過濾器(圖2)；而主動式RABS，其A級環(huán)境配備有獨立的高效過濾器(圖3)。

圖3 主動式RABS模式圖

根據(jù)氣流的運行方式不同，RABS又可以分為開放式RABS和封閉式RABS。其主要區(qū)別在于，開放式RABS，是將A級環(huán)境的氣流直接排入周圍B級環(huán)境的潔凈室中(圖4)；而封閉式RABS，其配備有自循環(huán)氣流通路，氣流在封閉的A級環(huán)境中內(nèi)循環(huán)，不會排放到周圍B級環(huán)境的潔凈室內(nèi)(圖5)。

圖4 開放式RABS

圖5 封閉式RABS

2.3 無菌隔離器技術(shù)

是在限制進出屏障系統(tǒng)RABS出現(xiàn)之后又發(fā)展起來的一種更為先進的無菌隔離技術(shù)。FDA對無菌隔離器的定義為“A decontaminated unit，supplied with class 100(ISO5)or higher air quality，that provides uncompromised，continuous isolation of its interior from the external environment(e.g. surrounding cleaning room air and personnel)”，即一種使用百級以上的清潔空氣氣流，絕對、連續(xù)地將內(nèi)部環(huán)境(操作環(huán)境)和外部環(huán)境(如周圍的潔凈室空氣和人員)隔開以隔絕污染的裝置。就是說無菌隔離器技術(shù)是采用完全密閉的裝置將操作空間(A級環(huán)境)與周圍環(huán)境完全隔離，并配備相應(yīng)的空氣處理單元(包含高效過濾器)以及過氧化氫滅菌裝置，可以自動完成裝置內(nèi)部的環(huán)境滅菌、空氣凈化處理等工作，具有極高的安全性，如圖6所示。

圖6 無菌隔離器系統(tǒng)示意圖

目前，在悉生生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，實驗和生產(chǎn)環(huán)境對潔凈度要求越來越高，主要是以下兩個方面的要求：

(1)無菌動物、悉生動物及悉生態(tài)本身需要無菌環(huán)境；

(2)實驗和生產(chǎn)對象要求避免環(huán)境微生物污染，必須保證實驗和生產(chǎn)操作過程在無菌環(huán)境下完成。

另外，隨著生物安全管理的日益嚴苛，病原菌研究的隔離措施也越來越嚴。無菌隔離技術(shù)不僅可以防止環(huán)境微生物污染研究對象，也可以防止正在研究的病原菌污染環(huán)境。因此，在實驗環(huán)境國標(biāo)(GB14925)中，隔離環(huán)境是分為正壓和負壓的[2]。

無菌隔離器已發(fā)展壓力為正負壓的各種類型的無菌隔離器系統(tǒng)，包括隔離艙體、空氣處理系統(tǒng)、過氧化氫噴霧消毒自動滅菌系統(tǒng)、雙門快速無菌環(huán)境傳遞系統(tǒng)等。隔離器內(nèi)的潔凈度能夠達到5級，保障隔離器內(nèi)的無菌環(huán)境。國家食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，在藥品生產(chǎn)和檢驗中使用的隔離系統(tǒng)，應(yīng)配備7級或更高級別潔凈空氣過濾裝置，并使內(nèi)部環(huán)境與外環(huán)境完全隔離[3]。隔離器的艙體屏障對操作人員提供了安全有效的防護，使操作人員徹底地從傳統(tǒng)的潔凈室中解放出來；同時無需龐大的凈化系統(tǒng)支持，艙內(nèi)外完全的隔離，使無菌隔離器在一般清潔環(huán)境中可隨意移動，相當(dāng)于一個可移動的、高潔凈級別的微型實驗室。

3 無菌隔離器的優(yōu)勢與應(yīng)用

無菌隔離器技術(shù)與傳統(tǒng)潔凈室、限制進出屏障系統(tǒng)(RABS)相比，具有明顯的優(yōu)勢：

(1)避免安全風(fēng)險

傳統(tǒng)的潔凈室，由于操作環(huán)境與周圍環(huán)境沒有物理隔離，容易產(chǎn)生交叉污染。另外，操作人員直接在潔凈室中工作，人員本身會導(dǎo)致固體顆粒的產(chǎn)生和對潔凈室層流的破壞。其中，人員、環(huán)境極易與高活性、高毒性的樣品接觸，不利于保護人員的安全。事實證明，潔凈室內(nèi)的微生物和固體顆粒濃度也只能控制在10-3的水平[4]。

開放式RABS系統(tǒng)，A級的操作環(huán)境與B級的潔凈室被物理屏障隔開，操作人員采用手套操作，很大程度減少了潔凈室環(huán)境交叉污染的可能性，在保證產(chǎn)品質(zhì)量和保護人員的安全方面都有非常好的效果。但是，由于開放式RABS與潔凈室共用同一高效過濾器的空調(diào)系統(tǒng)，雖然控制微生物和粒子污染的能力增強，但還是存在交叉污染的可能性。

封閉式RABS系統(tǒng)，A級的操作環(huán)境內(nèi)部配備有獨立的空氣凈化單元，且RABS內(nèi)部的空氣為循環(huán)使用，將人員、環(huán)境與產(chǎn)品幾乎完全隔離開來，所以避免微生物和粒子污染風(fēng)險的安全性大大提高。實踐證明，可以使用封閉式RABS系統(tǒng)進行一些易變質(zhì)、高活性和高毒性的樣品測試或生物制品的生產(chǎn)。然而，檢測數(shù)據(jù)表明，封閉式RABS的A級操作環(huán)境與外部環(huán)境之間仍然不能夠達到標(biāo)準(zhǔn)要求的絕對隔離，還需要外部環(huán)境潔凈空間作為背景。

與傳統(tǒng)潔凈室和RABS不同的是，無菌隔離器系統(tǒng)能夠?qū)級的操作環(huán)境與外部環(huán)境和人員完全隔離。操作環(huán)境內(nèi)部不僅配備單獨的高效過濾器，而且還配備有獨立空氣處理單元，相當(dāng)于一個獨立的潔凈空間，同時還配有過氧化氫滅菌系統(tǒng)，可以獨立對其箱體內(nèi)表面和設(shè)備表面進行滅菌。因此，無菌隔離器可以完全擺脫周圍環(huán)境也需要凈化處理的背景限制，簡化了無菌操作的復(fù)雜性。

(2)降低成本

1)建筑成本：由于RABS與傳統(tǒng)潔凈室建筑上相同，需要B級環(huán)境為背景，因此建筑費用沒有很大區(qū)別。而對于無菌隔離器來說，由于B級的環(huán)境背景不再是必需條件，傳統(tǒng)潔凈室中的B級背景部分可以取消，從而降低了建筑成本。

2)設(shè)備成本：由于RABS是在傳統(tǒng)潔凈室中增加了RABS，必然導(dǎo)致設(shè)備成本高于潔凈室，而無菌隔離器系統(tǒng)由于加裝了過氧化氫處理系統(tǒng)和獨立的空氣處理單元，因此設(shè)備成本較其他方式要高。

3)運行成本：RABS與傳統(tǒng)潔凈室相比沒有改變?nèi)魏蔚臐崈艏墑e，因此其能源消耗(主要為空調(diào)系統(tǒng)，包括空氣處理、溫度和濕度的控制)、潔凈服的使用成本等均相同，同時由于RABS的引入又帶來更多的監(jiān)測項目如RABS手套的檢查、空調(diào)系統(tǒng)的檢測等，因此RABS的運行成本會略高于傳統(tǒng)潔凈室。而無菌隔離器因為不存在B級環(huán)境，可以大大減少能耗、檢測設(shè)備以及人工。因此，無菌隔離器是三者中運行成本最低的。據(jù)測算，傳統(tǒng)潔凈室的運行費用是隔離器的3倍[5]。

通過以上分析可以看出，在避免污染風(fēng)險方面，無菌隔離器安全性最高；在成本投入方面，無菌隔離器雖然設(shè)備本身成本較高，但因為降低了建筑費用和基礎(chǔ)設(shè)施費用，所以總固定資產(chǎn)投資成本最低；在運行成本方面，無菌隔離器因沒有了B級環(huán)境背景從而簡化了無菌操作的復(fù)雜性，故運行成本最低。

因為無菌隔離器本身的特點和優(yōu)勢，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)得到了越來越廣泛的應(yīng)用。發(fā)達國家在制藥、生物制品等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方面有關(guān)裝備的描述中，都有對無菌隔離器的定義和要求。無菌隔離器與超凈工作臺連接使用，可以最大程度保證實驗操作的安全性[6]。

2011 年3月1日我國制藥行業(yè)實行了新版GMP。在新版GMP中對無菌藥品的生產(chǎn)要求更加嚴格，首次提出了無菌藥品生產(chǎn)隔離概念，提出無菌藥品生產(chǎn)工藝，明確了生產(chǎn)工藝對應(yīng)環(huán)境級別的要求，自動化進出料和隔離化的環(huán)境控制已成為藥品生產(chǎn)不可逆轉(zhuǎn)趨勢，無菌隔離器必然起到關(guān)鍵的作用。同時，隨著我國生物領(lǐng)域研究水平的發(fā)展，無菌隔離器在國內(nèi)悉生生物學(xué)科領(lǐng)域中逐漸得到推廣，許多生物科學(xué)工作者根據(jù)研究需要也都開始引進和使用無菌隔離器系統(tǒng)。

4 結(jié)語

綜上所述，相對于傳統(tǒng)潔凈室和RABS而言，無菌隔離器具備安全性高、投入運行成本低的特點。隨著我國政府對實驗動物使用、藥品生產(chǎn)的要求日益嚴格，無菌隔離器已在我國制藥行業(yè)得以普及。我國隨著新GMP 的施行，逐漸與國際GMP接軌，無菌隔離器技術(shù)將是無菌隔離技術(shù)的最重要發(fā)展趨勢。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展，無菌隔離器技術(shù)與自動化技術(shù)相結(jié)合是當(dāng)前中國悉生生物學(xué)研究手段的一個發(fā)展方向，其宗旨是通過無菌隔離以及對操作者限制進出的干預(yù)，從而降低悉生生物受到外界環(huán)境污染；另一方面，在進行有毒性或高致敏性實驗時，可以有效地保證操作人員的生物安全。

參考文獻：

[1] Quality Risk Management for Aseptic Processes, PDA Technical Report 2008，44(62)： S-1.

[2] 全國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.實驗動物環(huán)境及設(shè)施[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011：3-4.

[3] 衛(wèi)生部.藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(2010年修訂)[S]. 北京：衛(wèi)生部2011第79號令.

[4] 馬偉、孫石磊.無菌隔離器的優(yōu)勢及其發(fā)展趨勢[J].中國制藥裝備，2013，(7)：33-36.

[5] Beyeler N. Porter.M “Barrier Isolator Cost Analysis Revisited”ISPE,2009 Wastington Conference June 1 2009 Arlington,VA.

[6] 李志滿，田之寧.無菌隔離器與超凈工作臺、潔凈層流柜的直連改造嘗試[J].實驗動物科學(xué)，2010,27(4)：68-69.