江勤芳，高家紅，曾 橋，唐東紅，和占龍，馬開利

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所藥物安全性評價(jià)研究中心，昆明 650118；2.同濟(jì)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海 200039)

非人靈長類動(dòng)物在生物進(jìn)化、生殖生理等方面與人類極為相似，擁有與人類相似的單子宮，盤狀血絨毛型胎盤，尤其是雌性恒河猴，它們具有與人相似的月經(jīng)周期，是研究人類生育調(diào)控機(jī)制、體外受精及胚胎移植的理想動(dòng)物[ 1-2]。非人靈長類動(dòng)物(包括恒河猴、食蟹猴等其它非人靈長類動(dòng)物)體外受精及胚胎移植研究的開展將為人類生殖及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立提供更為廣闊的應(yīng)用前景。而合理化及標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)室的建設(shè)，是確保研究順利開展的前提條件。非人靈長類動(dòng)物體外受精-胚胎移植手術(shù)室既具有“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施”的特點(diǎn)，又具有人類醫(yī)療手術(shù)室的某些特征；既要滿足人員在潔凈室內(nèi)操作的要求，又要滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需要[ 3]。因此我們綜合考慮了人員、動(dòng)物以非人靈長類動(dòng)物體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)研究的需要，并結(jié)合本中心實(shí)際情況建立了手術(shù)室。目前已經(jīng)順利開展了15只實(shí)驗(yàn)猴的取卵及胚胎移植工作，現(xiàn)將相關(guān)工作進(jìn)行總結(jié)及探討。以下將從硬件建設(shè)、軟件建設(shè)及使用幾個(gè)方面分別進(jìn)行探討。

1 硬件

(IVF-ET)實(shí)驗(yàn)人員必須依賴和利用相應(yīng)的儀器設(shè)備，才能進(jìn)行各種精細(xì)的操作，并為卵子受精和胚胎發(fā)育提供一個(gè)穩(wěn)定、可靠的環(huán)境。

1.1 房間布局

手術(shù)室設(shè)置在配有空調(diào)凈化系統(tǒng)的屏障系統(tǒng)內(nèi)，通過空調(diào)系統(tǒng)對空氣進(jìn)行初效、中效和高效三級過濾，嚴(yán)格控制進(jìn)入室內(nèi)空氣中的微粒數(shù)量，確保整個(gè)手術(shù)室空氣質(zhì)量及房間內(nèi)溫度達(dá)到相應(yīng)要求。屏障系統(tǒng)需通過相關(guān)管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，取得《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證》后方可開展非人靈長類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)人員通過更衣室(一更、二更)、使用自動(dòng)凈手器洗手消毒后進(jìn)入屏障環(huán)境內(nèi)，同時(shí)還要對進(jìn)入室內(nèi)的器具、實(shí)驗(yàn)耗材等進(jìn)行消毒滅菌。

1.2 全數(shù)字超聲診斷系統(tǒng)

非人靈長類動(dòng)物體外受精-胚胎移植手術(shù)室可選用獸用超聲診斷儀。B超儀是必不可缺的有效工具，在此實(shí)驗(yàn)中貫穿整個(gè)過程。非人靈長類動(dòng)物尚未注射促排卵藥物之前，首先需要用B超確認(rèn)動(dòng)物是否處于非受孕狀態(tài)，確認(rèn)處于非懷孕期的動(dòng)物即可觀察子宮情況，包括子宮大小及子宮內(nèi)膜周期性變化。在使用促排卵藥物之后，可用B超觀察卵泡的生長發(fā)育情況[ 4]，卵泡成熟后可在B超下看到清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而能夠根據(jù)B超的結(jié)果分析和評估藥物促排卵效果，最終確定動(dòng)物取卵的時(shí)間點(diǎn)。在施行外科手術(shù)之前，為便于對卵巢的手術(shù)操作，需要B超仔細(xì)觀察動(dòng)物腹腔內(nèi)狀況。胚胎移植后，需用B超觀察動(dòng)物是否受孕。因此，B超診斷系統(tǒng)應(yīng)配置不同分辨率的腹部凸陣探頭、線陣探頭，同時(shí)具有前沿的成像技術(shù)、完善的數(shù)據(jù)管理才能確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

1.3 電刺激采精儀全套

電刺激采精是非人靈長類人工受精、體外受精和精子生物學(xué)研究過程中獲得精子的基本手段。在有關(guān)非人靈長類電刺激采精的報(bào)道中，陰莖和直腸電刺激采精是較常用的方法[5]。動(dòng)物電刺激采精儀是利用低電壓小電流交流電刺激動(dòng)物輸精管壺腹部附近的感覺神經(jīng)末梢,然后傳導(dǎo)到射精中樞,產(chǎn)生興奮而排精的人工采精方法。本中心在開展實(shí)驗(yàn)前購置了電刺激采精儀，選用直腸刺激的方法進(jìn)行精液的采集。電刺激采精儀應(yīng)配備與非人靈長類動(dòng)物適合的刺激電擊棒，電擊棒粗細(xì)的直徑約為1.5 cm，長度為30 cm左右即可。具有電壓、電流的選擇按鈕，刺激過程中可方便電流或電壓調(diào)諧。同時(shí)具備電源手動(dòng)和自動(dòng)切換開關(guān)，便于實(shí)驗(yàn)人員控制連續(xù)刺激或間隙刺激時(shí)間。刺激電擊棒在使用時(shí)，在前端要涂抹少量凡士林，以潤滑電極棒。實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)不同的個(gè)體及動(dòng)物臨床表現(xiàn)選擇電流的大小或刺激時(shí)間的長短。

1.4 顯微操作注射系統(tǒng)

包括倒置顯微鏡、精確定位的顯微注射操作器及成像系統(tǒng)(圖1)。倒置顯微鏡應(yīng)具備霍夫曼調(diào)制相差(Hoffman Modulationcontrast)及微分干涉相差(differential interference phase contrast microscope，DIC)功能，以便能夠形成高對比度的圖像，從而可以較好地使用塑料培養(yǎng)皿來觀察卵細(xì)胞，便于顯微操作。顯微鏡及顯微操作需通過同一系統(tǒng)進(jìn)行控制，從而實(shí)現(xiàn)將單一精子注射入卵子內(nèi)使其受精的操作過程。顯微操作注射系統(tǒng)應(yīng)具有較高分辨率、對比度以及人性化的操作系統(tǒng)，以便有效提高單精子卵胞漿顯微注射的成功率。

圖1 顯微操作注射系統(tǒng)

1.5 其它必需設(shè)備

(1)顯微鏡及顯微恒溫?zé)崤_。選用工作距離大、聚焦深度大的解剖顯微鏡，其物鏡放大倍數(shù)為×0.7～×11.5，目鏡×10，可方便選卵、觀察胚胎。體外胚胎對溫度的變化非常敏感，顯微恒溫?zé)崤_是必備的輔助設(shè)備，其溫控性能需穩(wěn)定可靠，使溫度能長時(shí)間穩(wěn)定在所需要的數(shù)值上。(2)三氣培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)中研究對象均來自于非人靈長類動(dòng)物機(jī)體，細(xì)胞的體外培養(yǎng)要求非常嚴(yán)格，不僅要有適合的溫度、濕度，且要有潔凈的氣流循環(huán)。三氣培養(yǎng)箱是指可供有氮?dú)?、二氧化碳和氧氣三種氣體的培養(yǎng)箱，三種氣體的比例通常是氮?dú)?0%、二氧化碳5%、氧氣5%?？蔀榕咛ヌ峁┫鄬Ψ€(wěn)定的體外生長環(huán)境，如恒定的酸堿度(pH:7.2～7.4)、穩(wěn)定的溫度(37℃)、較高的相對濕度(95%)、穩(wěn)定的CO2水平，使胚胎完成體外發(fā)育，配子離體后幾乎所有的時(shí)間都在培養(yǎng)箱內(nèi)完成其體外發(fā)育，因此培養(yǎng)箱的精確性非常重要[7]。培養(yǎng)箱箱內(nèi)采用微風(fēng)循環(huán)方式，使空氣循環(huán)接近自然界空氣對流，縮短溫度、濕度、O2濃度和CO2濃度的恢復(fù)時(shí)間，確保溫度、濕度、O2濃度和CO2濃度的均衡性。其應(yīng)具有清晰的操作控制界面，該界面一方面顯示箱體內(nèi)的實(shí)時(shí)溫度、濕度、氣體濃度，又要方便操作者進(jìn)行數(shù)值的設(shè)定或校正。其次，應(yīng)具備數(shù)值異常報(bào)警裝置，便于對其環(huán)境的監(jiān)控。(3)超凈工作臺。超凈工作臺是應(yīng)用于手術(shù)室的局部凈化單元，目的是保證工作區(qū)內(nèi)的風(fēng)速始終處于理想狀態(tài)，其環(huán)境條件滿足所需培養(yǎng)基、試劑的配制要求，同時(shí)方便開展實(shí)驗(yàn)用具制作等方面的工作，例如移卵玻璃毛細(xì)管拉制等。

1.6 (IVF-ET)外科手術(shù)所需配置

(1)動(dòng)物手術(shù)床。動(dòng)物手術(shù)床應(yīng)便于操作，具有溫度控制器，滿足動(dòng)物麻醉后在手術(shù)過程中的保溫需求。同時(shí)，手術(shù)床應(yīng)具有調(diào)節(jié)升降的功能，增加動(dòng)物在手術(shù)中的舒適度并便于實(shí)驗(yàn)人員操作。在手術(shù)中通常將溫度調(diào)節(jié)到30℃左右[6]。當(dāng)動(dòng)物處于深麻醉狀態(tài)需使用較高的臺面溫度時(shí)，在手術(shù)過程中需適時(shí)輕輕移動(dòng)動(dòng)物，以免動(dòng)物局部不適。(2)無影燈。在對動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)過程中，無影燈可以有效照射手術(shù)部位，避開血管并便于對卵巢及輸卵管的觀察，在手術(shù)中應(yīng)方便使用，操作簡單，可通過移動(dòng)進(jìn)行光源遠(yuǎn)近式調(diào)節(jié)，以及通過旋鈕對燈頭高度和角度進(jìn)行調(diào)節(jié)。(3)心電監(jiān)護(hù)儀。為提高對手術(shù)中非人靈長類動(dòng)物的關(guān)懷，采用心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)護(hù)主要的生命指標(biāo):心率、心電圖、呼吸、脈搏等。在手術(shù)過程中，可根據(jù)手術(shù)時(shí)間長短及動(dòng)物麻醉狀況決定是否啟用心電監(jiān)護(hù)儀。(4)手術(shù)器械全套。在實(shí)驗(yàn)開始前，購置適合非人靈長類動(dòng)物的全套手術(shù)器械。包括組織鉗、止血鉗、卵圓鉗、手術(shù)剪、手術(shù)刀、拉鉤、縫合針及縫合線，準(zhǔn)備無菌紗布及棉花等器械及耗材，在實(shí)驗(yàn)前一天打包進(jìn)行高壓滅菌處理、烤干后備用。

2 軟件

非人靈長類動(dòng)物體外受精-胚胎移植(IVF-ET)手術(shù)室的建設(shè)，硬件和軟件缺一不可。

2.1 創(chuàng)建一個(gè)團(tuán)結(jié)和良好合作的團(tuán)隊(duì)

由于非人靈長類動(dòng)物(IVF-ET)還在起步探索階段，可與有豐富經(jīng)驗(yàn)的人類輔助生殖中心聯(lián)合開展實(shí)驗(yàn)，以便在關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面得到積極和有效的指導(dǎo)。

2.2 具有熟練掌握顯微注射、卵細(xì)胞培養(yǎng)、精子冷凍及復(fù)蘇、胚胎培養(yǎng)等胚胎移植相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的人員。

2.3 配備熟練掌握操作B超儀的技術(shù)人員，以便能對B超圖像進(jìn)行熟練采集并作出科學(xué)正確的判斷，并能在B超圖像的引導(dǎo)下，快速及準(zhǔn)確對動(dòng)物進(jìn)行外科手術(shù)。

2.4 對動(dòng)物精心護(hù)理的飼養(yǎng)人員及獸醫(yī)師

在實(shí)驗(yàn)中能及時(shí)發(fā)現(xiàn)非人靈長類動(dòng)物的月經(jīng)及其它異常情況，給予準(zhǔn)確合理的處理方案。同時(shí)規(guī)范麻醉藥的用量及完成動(dòng)物手術(shù)中生命體征的監(jiān)護(hù)，確保動(dòng)物在手術(shù)前及手術(shù)后能得到精心和細(xì)致的護(hù)理。

3 手術(shù)室的使用

目前，本中心手術(shù)室已開展15例非人靈長類動(dòng)物的IVF-ET研究。B超過程中，選用分辨率為6.5 MHz的探頭可清楚觀察到卵巢，但因人類的陰道探頭外形直徑較大而不適用于非人靈長類動(dòng)物陰道探測，因此首先選用此探頭直接在腹部觀察實(shí)驗(yàn)猴經(jīng)促排卵藥物處理后卵泡的生長發(fā)育情況(圖2)，然后再通過腹部手術(shù)切口，暴露卵巢后用注射器直接抽取卵泡的的方式獲取卵子。今后在開展實(shí)驗(yàn)的過程中可與B超機(jī)生產(chǎn)廠家聯(lián)系，爭取開發(fā)或選購到直徑大小適宜非人靈長類動(dòng)物陰道探測的探頭，從而對超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)進(jìn)行積極的探索和嘗試。超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵具有簡便、快捷，痛苦小、創(chuàng)傷小，不用全身麻醉和并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)[8]，在今后非人靈長類動(dòng)物的IVF-ET中，有必要對陰道穿刺取卵術(shù)開展一些有效的探索。

圖2 促排卵后，月經(jīng)周期第12天卵巢B超圖

在本中心開展的實(shí)驗(yàn)研究中，由于對三氣培養(yǎng)箱密集使用，氮?dú)庀谋容^快，而頻繁的更換氮?dú)馄浚矊κ中g(shù)室環(huán)境帶來了潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。在今后改進(jìn)及完善過程中，可使用氮?dú)獍l(fā)生器，從而減少更換氮?dú)馄繉Νh(huán)境的潛在污染。研究實(shí)驗(yàn)中為下一步轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的開發(fā)進(jìn)行探索，沒有采用精子和卵混合培養(yǎng)方式完成體外受精，而是借助單精子卵母細(xì)胞內(nèi)注射受精技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)實(shí)現(xiàn)精卵結(jié)合完成受精過程。ICSI受精的胚胎有與自然受精形成的胚胎相似的發(fā)育潛力，其具有受精率高、精子濃度形態(tài)對受精無影響的特點(diǎn)[7]，對開展的實(shí)驗(yàn)研究起到積極的促進(jìn)作用。缺點(diǎn)是設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時(shí)間反復(fù)的練習(xí)，在練習(xí)過程難免會(huì)發(fā)生把針弄斷的情況。在有條件的手術(shù)室，可配置拉針器、磨針器和鍛針器，更好便于初學(xué)者對顯微操作技術(shù)的練習(xí)。

4 討論

非人靈長類動(dòng)物(IVF-ET)手術(shù)室的建立，將使非人靈長類動(dòng)物在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究向更深層次拓展，并將更充分發(fā)揮其在研究人類生殖疾病方面的作用。建立非人靈長類動(dòng)物體外受精-胚胎移植手術(shù)室是一個(gè)系統(tǒng)工程。除上述以外，一些實(shí)驗(yàn)儀器也是必需的，例如用于存放需冷凍及冷藏試劑的冰箱；用于胚胎冷凍保存的液氮罐；電子天平、純水儀等。手術(shù)室建立后，需建立可行的手術(shù)室管理規(guī)章制度及操作規(guī)程；在手術(shù)前、后需對環(huán)境進(jìn)行合理有效消毒，使環(huán)境及實(shí)驗(yàn)體系處于有效地質(zhì)量控制之下，才能確保手術(shù)室得到規(guī)范化使用。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)珍惜和善待動(dòng)物，采取動(dòng)物福利的相關(guān)措施，給予動(dòng)物人性化關(guān)懷。本中心的手術(shù)室工作距離短，便于實(shí)驗(yàn)人員操作，可進(jìn)行快速取卵和取精。但由于手術(shù)室是在土建施工完成后因地制宜而建立，所以也存在不完善的地方。例如手術(shù)室面積不夠大，實(shí)驗(yàn)設(shè)備配置多。為保障多人在手術(shù)室內(nèi)的有序操作，需要建立相應(yīng)的規(guī)章制度及操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。與人類的輔助生殖相比，非人靈長類動(dòng)物的(IVF-ET)尚在探索和起步階段，不論從硬件和軟件上，還有一定差距，今后在擴(kuò)建非人靈長類動(dòng)物手術(shù)室過程中可嘗試參照人類的改進(jìn)和進(jìn)一步完善。

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