陳良恩，詹 皓，吳 峰，趙安東，楊明浩

(空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100142)

持續(xù)高正加速度(positive acceleration，+Gz)作用可以導(dǎo)致機(jī)體劇烈的應(yīng)激反應(yīng)和血液動(dòng)力學(xué)變化，激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。國內(nèi)外大量研究表明[1-3],交感腎上腺素能系統(tǒng)、腎素血管緊張素系統(tǒng)、內(nèi)皮素以及前列環(huán)素等在高+Gz應(yīng)激時(shí)均會(huì)發(fā)生明顯變化。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變有助于高+Gz應(yīng)激時(shí)機(jī)體血流量的調(diào)節(jié)和血壓的保持，提高機(jī)體抗+Gz應(yīng)激能力，但應(yīng)激激素的分泌紊亂以及持續(xù)作用容易造成組織細(xì)胞的損傷[4]。復(fù)方紅景天制劑是由紅景天、黃芪、白芍、當(dāng)歸等組成的中藥制劑，單體成分具有清除氧自由基、改善微循環(huán)及心血管功能、增強(qiáng)免疫力、提高機(jī)體抗應(yīng)激能力等作用。前期研究表明[5-6]，該復(fù)方制劑對(duì)大鼠高+Gz應(yīng)激導(dǎo)致的心腦損傷具有一定的保護(hù)作用。本文采用+10 Gz持續(xù)性作用建立大鼠+Gz損傷模型，通過觀察復(fù)方紅景天制劑對(duì)機(jī)體重要的應(yīng)激激素-糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)及其受體(glucocorticoid receptor，GR)表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示該制劑對(duì)高+Gz應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用，探討該制劑對(duì)持續(xù)正加速度致心肌損傷的相關(guān)保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物

復(fù)方紅景天制劑，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)室提供，該制劑主要由紅景天、黃芪、當(dāng)歸、白芍、丹參等成分組成，采用乙醇回流提取工藝提取復(fù)方有效成分。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，體重(200±25)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證:[SCXK(京) 2011-0004]；飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第304臨床部[SYXK(軍) 2007-011]。

1.3 試劑與儀器

兔抗大鼠GR多克隆抗體及GAPDH多克隆抗體，美國Santa Cruze 公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，北京科宇深藍(lán)科技有限公司；GC酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，美國R&D公司；其余試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。動(dòng)物離心機(jī)，長春奧普光電公司；Wellscan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀，芬蘭Labsystems Dragon公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用抽簽法將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、應(yīng)激對(duì)照組、+10 Gz應(yīng)激組和藥物低、中、高劑量組，每組12只，各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)并作標(biāo)記。各組動(dòng)物每天上午灌胃給藥1次，連續(xù)14 d，給藥體積為20 mL/kg，每只動(dòng)物每天灌胃前稱取體重以確定灌藥量，低、中、高劑量組大鼠每天分別按0.75 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg給予復(fù)方紅景天中藥制劑，其余3組動(dòng)物給等量的生理鹽水。末次給藥當(dāng)日20:00開始禁食，次日進(jìn)行離心機(jī)暴露。

1.4.2 動(dòng)物離心機(jī)暴露模型建立

采用動(dòng)物離心機(jī)進(jìn)行+Gz暴露，將大鼠束縛固定在通氣的動(dòng)物艙中，置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)臂上，大鼠頭部朝向離心機(jī)旋轉(zhuǎn)軸心。離心機(jī)半徑為2 m，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行加速度程序控制。實(shí)驗(yàn)組大鼠暴露+10 Gz水平，持續(xù)5 min，加速度增長率為1G/s。空白對(duì)照組不做任何處理，應(yīng)激對(duì)照組動(dòng)物在離心機(jī)艙內(nèi)轉(zhuǎn)臂上束縛5 min，不做離心處理。

1.4.3 大鼠血清GC測定

大鼠+10 Gz作用后4 h，麻醉，心臟取血，分離血清。采用GC酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清皮質(zhì)酮濃度。

1.4.4 大鼠心肌組織GR測定

大鼠斷頭處死，速取心臟，用4℃生理鹽水沖洗，剪取大鼠新鮮的左心室肌組織，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊，勻漿，使用哺乳動(dòng)物組織總蛋白抽提試劑盒提取蛋白樣品，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，操作步驟按說明書進(jìn)行。每個(gè)樣品取50 μg蛋白質(zhì)加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至NC膜，1% BSA 封閉過夜，PBST洗膜兩次，加入1:800稀釋兔抗大鼠GR多克隆抗體，37℃孵育1 h，內(nèi)參采用兔抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體。PBST洗膜，加1∶3000稀釋的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，PBST洗膜。在NC膜上滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，然后在暗室中曝光X線片。采用Quantity One v4.6.2 軟件進(jìn)行光密度值分析，GR蛋白的表達(dá)量以GR對(duì)應(yīng)條帶與同組GAPDH 條帶的光密度值的比值表示。

注：1. 空白對(duì)照組; 2. 應(yīng)激對(duì)照組; 3. +10 Gz應(yīng)激組; 4. 藥物低劑量組; 5. 藥物中劑量組; 6. 藥物高劑量組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方紅景天制劑對(duì)大鼠+10 Gz暴露后血清皮質(zhì)酮濃度的影響

與空白對(duì)照組和應(yīng)激對(duì)照組大鼠相比，+10 Gz應(yīng)激組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度明顯升高(P< 0.01)。復(fù)方紅景天制劑劑量依賴式降低血清皮質(zhì)酮濃度，藥物中劑量組和高劑量組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度明顯低于+10 Gz應(yīng)激組(P< 0.05)(表1)。

2.2 復(fù)方紅景天制劑對(duì)大鼠+10 Gz暴露后心肌組織糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響

大鼠心肌GR表達(dá)的western blot結(jié)果如圖1。測定各條帶光密度，分析各組大鼠心肌GR表達(dá)水平，結(jié)果如表2。+10 Gz應(yīng)激組大鼠心肌GR的表達(dá)水平與空白對(duì)照組和應(yīng)激對(duì)照組相比明顯降低(P< 0.01，P< 0.05)。復(fù)方紅景天制劑預(yù)處理大鼠心肌GR表達(dá)水平明顯升高，三個(gè)不同劑量的藥物組大鼠GR表達(dá)水平均顯著高于+10 Gz應(yīng)激組(P< 0.05，P< 0.01)。

表1 各組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度的變化 (n=12)

表2 各組大鼠心肌組織GR蛋白表達(dá)變化 (n=6)

3 討論

當(dāng)機(jī)體受到強(qiáng)烈刺激時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)的強(qiáng)烈興奮導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)生成和釋放GC增加，導(dǎo)致血液中GC水平的升高。GC生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮取決于靶細(xì)胞上GR的介導(dǎo)。GR屬于激素核受體家族的主要成員，同時(shí)也是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。游離的GC通過彌散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，迅速與胞漿內(nèi)GR 結(jié)合，此時(shí)受體被活化，激素受體復(fù)合物進(jìn)而轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與靶基因的GC反應(yīng)元件相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，并最終引起各種生物學(xué)效應(yīng)[7]。GR的含量是細(xì)胞對(duì)GC反應(yīng)的一個(gè)決定性因素[8]。

同以往對(duì)腎上腺素、去甲腎上腺素以及內(nèi)皮素等其他應(yīng)激激素的研究結(jié)果相似，高+Gz應(yīng)激大鼠血清GC水平明顯升高，GC水平的升高對(duì)提高大鼠的抗+Gz應(yīng)激能力有一定作用，它可以減少應(yīng)激反應(yīng)有害介質(zhì)(緩激肽、蛋白水解酶、前列腺素等)的產(chǎn)生和釋放；使能量代謝以糖代謝為中心，保證葡萄糖對(duì)腦、心臟重要器官的供應(yīng)；同時(shí)對(duì)兒茶酚胺的允許作用，使心肌收縮力增強(qiáng)，升高血壓。但高水平GC可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已被許多研究證實(shí)[9-10]。高+Gz應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞和海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的增多[11-12]，可能與高+Gz應(yīng)激條件下GC水平升高有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照和應(yīng)激對(duì)照相比，高+Gz應(yīng)激組大鼠GR表達(dá)水平明顯降低。有研究認(rèn)為，應(yīng)激情況下，GR的降低與血漿GC濃度的升高有關(guān)，GC對(duì)GR和GR mRNA均具有反向調(diào)節(jié)作用[13]。同時(shí)，也有研究認(rèn)為GR的下調(diào)還存在以下幾種可能：激素受體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到核內(nèi)；應(yīng)激時(shí)受體蛋白分解加速，而合成減少；糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合活性降低[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下炎癥因子如TNF、IL-1等也可以抑制GR的表達(dá)[15]。應(yīng)激狀態(tài)下GR表達(dá)水平下調(diào)一定程度上可以降低靶細(xì)胞對(duì)激素的反應(yīng)性，防止因激素的持續(xù)作用對(duì)靶細(xì)胞造成損傷[13]。但GR的降低會(huì)造成機(jī)體對(duì)GC的抵抗，繼發(fā)性的引起大量炎性因子分泌增多，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)的發(fā)生。在各種應(yīng)激過程中，GR的減少可促使休克、多器官功能衰竭的發(fā)生，且糖皮質(zhì)激素受體的減少幅度與病理性應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度平行[16]。

在本研究中，實(shí)驗(yàn)觀察到復(fù)方紅景天制劑預(yù)處理可以降低高+Gz應(yīng)激大鼠血漿GC水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，提示該復(fù)方制劑對(duì)高+Gz應(yīng)激大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步檢測心肌細(xì)胞GR表達(dá)水平，復(fù)方紅景天制劑預(yù)處理組大鼠心肌GR高于高+Gz應(yīng)激組，并且也呈現(xiàn)劑量依賴性。GC濃度的降低和GR表達(dá)水平的升高，既增強(qiáng)了靶細(xì)胞對(duì)激素的敏感性，保證了應(yīng)激狀態(tài)下GC的有效生理效應(yīng)，同時(shí)也避免GC濃度過高導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。因此，該復(fù)方制劑對(duì)于保持高+Gz應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、預(yù)防心肌細(xì)胞的損傷具有重要作用。有關(guān)復(fù)方紅景天制劑對(duì)GC和GR作用的確切機(jī)制，有待于今后進(jìn)一步深入研究。

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