惠恩健，葛爾寧，盛振華，黃 真

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

動物用爪掛杠持久度實驗同屬于靜態(tài)抗疲勞實驗[1]，可用在抗疲勞、抗抑郁等藥物的研制及相關(guān)醫(yī)學(xué)研究中。當(dāng)動物在一個封閉的水池中游泳時，因恐懼或體力不支往往會尋找可以抓住的支撐點，而當(dāng)四爪及臂不能支撐整個身體重量時又會放棄掛杠掉入水中，如此重復(fù)多次，最終放棄抓杠。掛杠時間和次數(shù)可用于評價研制藥物的藥效及相關(guān)醫(yī)學(xué)作用。

這種讓動物自然抓杠掛臂的實驗方式可用于動物靜態(tài)疲勞的檢測，采用該方法測試動物抗疲勞能力目前國內(nèi)外均未見報道，類似動物抗疲勞實驗?zāi)壳霸跇I(yè)界有采用站線式、站杠式[1]等方法， 對動物來講，站立姿勢較易做到，持久度可較長，一次實驗時間相對較長，有時需要24 h以上，本文所述方法與前兩種的不同在于：本研究以動物多臂掛杠的姿勢進(jìn)行疲勞實驗，相比前者難度增加，持久度降低，相應(yīng)實驗時間縮短。實驗常用動物如小白鼠等的臂力有限，一次掛杠時間不會很長，如此可在水面上方加一活動細(xì)杠供其抓握，當(dāng)小鼠抓住細(xì)杠時，讓水位迅速下降，此時小鼠不再具浮力，體重全由爪和掛臂支撐，最多幾分鐘就會掉回水中，這時再讓水位復(fù)位，如此重復(fù)可進(jìn)行相應(yīng)疲勞實驗，相關(guān)自動檢測裝置可據(jù)此原理研制[1-3]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

ICR小鼠28只，雌雄各半，體重15～25 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】。浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心實驗動物【SYXK(浙)2013-0184】，10 L娃哈哈桶裝純凈水，購自杭州市玲玲飲用水商行(生產(chǎn)許可證編號：QS330006010302)。

1.2 實驗裝置研制方法

該裝置整體構(gòu)思和設(shè)計共分水池、傳感部分、系統(tǒng)控制硬件、系統(tǒng)控制軟件、面板按鈕功能等5部分(圖1)：

注：1. 實驗水槽； 2. 蓄水池； 3. 溫控器； 4. 潛水泵； 5. 電水閥； 6. 彈簧； 7. 光欄； 8. 光耦； 9. 橫杠； 10. 蓋板； 11. 可控出水口； 12. 進(jìn)水口； 13. 出水口； 14. 隔板A； 15. 隔板B； 16. 隔板C； 17. 活動蓋； 18. 控制器。

1.2.1 水池

水池由水槽1和蓄水池2兩部分組成，1尺寸為：高15 cm×長15 cm×寬8 cm，上有一8×7 cm2的活動蓋17，可供40～15 g重的小動物進(jìn)出，下端開有3個進(jìn)出水孔，11為可控出水口，由控制器18經(jīng)電水閥5控制，12為進(jìn)水口，由潛水泵4把2中的恒溫水不停注入1中，13為出水口，當(dāng)1中水位滿過隔板C 16時，由該出水口排入2，隔板A 14的作用是當(dāng)5打開，1水位下降時，保持1中水位不低于14高度(出水口出水速度遠(yuǎn)高于進(jìn)水速度)，隔板B 15可將實驗動物與進(jìn)出水口隔離。

蓄水池2體積2倍于1，內(nèi)置可調(diào)溫控器3和潛水泵4。如圖1， 4把2中的恒溫水恒流注入1，當(dāng)5關(guān)閉時，1中水位如滿過16，可經(jīng)13排回2，如此，可保持1中水位相對高位，實際設(shè)定高度為離橫杠9約1.2 cm距離。當(dāng)5打開時，1中水位如滿過14，即可經(jīng)11排回2，如此，可保持1中水位相對低位。

1.2.2 傳感部分

兩對光耦8分別安裝在上端蓋板10的窄相兩端，見圖1右上，彈簧6使8處常開狀態(tài)，當(dāng)動物下拉橫杠9時，帶動光欄7下移，8輸出信號改變，釋放9時，7上移，8輸出信號復(fù)原。在9上方的蓋板部位安裝一排LED燈，位置與橫杠平行，用磨砂玻璃蓋住形成無影光帶，便于動物尋找橫杠。

1.2.3 系統(tǒng)控制硬件

由常用51系列單片機(jī)AT89S51為主控芯片加TTL功能電路和模擬放大電路等組成的復(fù)合控制器來控制光耦信號的接收、電水閥的開關(guān)并顯示來自動物掛杠行為的實驗信息?？刂圃砜驁D見圖2，具體電路線路圖在此略去。

圖2 電路控制原理框圖

1.2.4 系統(tǒng)控制軟件

系統(tǒng)軟件主流程如圖3所示，具體程序在此略去。

圖3 系統(tǒng)軟件流程

1.2.5 面板按鈕功能

為簡易操作，面板僅設(shè)上下兩排4位LED顯示(實時計數(shù)顯示為上排右2位，查詢序號顯示為上排左2位，計時顯示為下排4位)、控制器電源開關(guān)、查詢按鈕和清零按鈕。

1.3 操作步驟

1.3.1 設(shè)置溫控器溫度，用純凈水加滿儲水箱，預(yù)熱至設(shè)定溫度后開啟控制器電源開關(guān)，此時計數(shù)和計時顯示自動清零，等待光耦信號到來；潛水泵把儲水箱中清水源源注入實驗水槽。待水位滿過隔板C 后，取小鼠，打開活動蓋放入水槽中，蓋上活動蓋，實驗開始。觀察小鼠在光壁的水槽中來回游水，最終會因恐懼或疲勞去抓水槽中唯一可支撐物橫杠，微小的負(fù)荷即可使橫杠下移，同時帶動光欄下移使光耦產(chǎn)生“閉”信號(橫杠的兩端都有光耦，兩光耦信號以“或”門輸出。)，該信號經(jīng)控制器使計數(shù)顯示累加1，并開始相應(yīng)計時，同時讓電水閥打開，槽中水位迅速下降至隔板A 位，此時，小鼠處于無浮力狀況下掛杠支撐，直至爪力或臂力不支掉入水中，同時橫杠在彈簧的作用下和光欄同步上移，光耦產(chǎn)生“開”信號，并使電水閥關(guān)閉，槽中水緩緩上升至隔板C位。至此，一次計數(shù)計時過程結(jié)束，控制器等待下一“閉”信號的到來，如此多次循環(huán)，直至小鼠放棄抓杠。

1.3.2 按“查詢”鈕，上排左兩位顯示掛杠次序，下排4位顯示相應(yīng)的持久時間，按次序循環(huán)顯示，按一次顯示一組。計數(shù)最多可達(dá)35次，一次計時最長可達(dá)9999 s。

1.3.3 按“清零”鈕，所有信息清零，等待下一個“閉”信號的到來。

1.4 實驗方法及測定指標(biāo)

28只小鼠共分A、B兩組，每組14只，雌雄各半，A組正常飼養(yǎng)，B組實驗前禁食不禁水24 h。按1.3項所述操作，儀器將根據(jù)小白鼠的掛杠次數(shù)和相應(yīng)掛杠持久時間自動記錄，一只小鼠的實驗時間可根據(jù)小鼠的體能及是否愿意多次掛杠來定，一只正常的小鼠一次實驗會有5～10次掛杠，體力差的不超過5次就不再愿意抓杠。由上述實驗方法分別測定A、B兩組小鼠的掛杠次數(shù)和相應(yīng)的掛杠持久時間。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 以柱狀圖的形式來表達(dá)實驗結(jié)果，見圖4：黑柱表示A組14例小鼠在各次掛杠時的持久時間平均值，白柱表示B組14例小鼠在各次掛杠時的持久時間平均值，橫坐標(biāo)為掛杠次序，縱坐標(biāo)為對應(yīng)各次掛杠時的持久時間。

注：■：A組； □：B組。

2.2 表1所列為2組小鼠掛杠次數(shù)和掛杠持久時間總和的平均值，由表1可知，禁食組平均掛杠次數(shù)、掛杠持久時間總和與正常組比較，均具有顯著性差異(P< 0.05)。

表1 禁食對小鼠掛杠次數(shù)和持久時間的影響(n=14)

從實驗結(jié)果看，兩組小鼠的平均掛杠次數(shù)和相應(yīng)掛杠持久時間差異明顯，充分說明該實驗方法及裝置在動物抗疲勞測試實驗中的適用性。

3 討論

本文采用51系列單片微機(jī)控制和記憶系統(tǒng)結(jié)合光耦傳感器、電控水閥等組合控制電路[4～7]，研制了一種能自動記錄小鼠在該實驗環(huán)境中的掛杠次數(shù)及掛杠持久時間的裝置。研制思路和檢測方式具一定的創(chuàng)新性和先進(jìn)性。作為該領(lǐng)域中的一種全新實驗方法和理念，配以自動化檢測手段，在業(yè)界可得到推廣應(yīng)用。

從上述實驗結(jié)果可見，掛杠式動物抗疲勞實驗的實驗時間較短，實驗觀察小鼠一次掛杠時間不超過3 min。經(jīng)多次抓杠掛杠后最終放棄抓杠，所以，一只小鼠的實驗時間一般不超出2 h。

相對較冷的環(huán)境更適合該實驗的進(jìn)行，曾經(jīng)試過在26℃以上的水溫和實驗室環(huán)境進(jìn)行該實驗，結(jié)果效果不佳，原因是由于實驗小鼠在一個較溫和的水環(huán)境中游水會感到相對悠閑，緊張和恐懼度不高，抓杠的意愿較弱，有時幾小時都不會去抓杠，如此，不利于實驗的進(jìn)行，22 ℃左右較合適。

該實驗不宜選擇太小的動物，如小于15 g的小白鼠，由于浮力的因素使小鼠掛杠時重力太小，帶不動光欄下移，無法產(chǎn)生有效信號。

實驗小鼠經(jīng)幾次掛杠后，經(jīng)常會出現(xiàn)一抓杠就放棄的干擾動作，查詢結(jié)果時如某次掛杠的對應(yīng)時間為零，可視為一次誤操作。

本裝置需在相對平靜平穩(wěn)的環(huán)境下工作，震蕩和過度傾斜會使水平面不穩(wěn)，影響實驗效果。在沒有意外情況干擾的前提下(如斷電等)，儀器可連續(xù)工作48 h。

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