魯 珽，陳方明，朱科燕，蔡月琴，壽旗揚(yáng)，潘永明，陳民利

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨床研究中心， 杭州 310009；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心， 杭州 310053)

肝纖維化是慢性肝炎發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，并證實(shí)肝纖維化進(jìn)入肝硬化前是可逆轉(zhuǎn)的?，F(xiàn)有大量的研究表明，自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化是引起肝損傷的主要原因之一，并參與肝纖維化進(jìn)程的各個(gè)環(huán)節(jié)。抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基是防治肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[1]。丹酚酸A(salvianolic acid A)是由丹參中提取的最主要的酸性水溶性單體成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗缺血、抗病毒等多種藥理作用，體外研究表明丹酚酸A能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞內(nèi)膠原合成[2]。并發(fā)現(xiàn)丹酚酸A對(duì)肝微粒體細(xì)胞色素P450酶系無(wú)明顯影響，提示丹酚酸A對(duì)藥物不良反應(yīng)無(wú)明顯作用[3]，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。本研究的注射用丹酚酸A是由北京本草天源藥物研究院和正大青春寶公司在研的Ⅰ類(lèi)心血管疾病治療新藥，前期研究已證實(shí)注射用丹酚酸A對(duì)缺血性心臟病具有很好的保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)對(duì)肺纖維化亦有一定的改善作用[4]。為此，本研究采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)，從細(xì)胞水平和在體實(shí)驗(yàn)觀察注射用丹酚酸A抗肝纖維化的作用，并初步探討丹酚酸A抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，32只，來(lái)源于上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2008-0016】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境【SYXK(浙)2008-0115】；人肝細(xì)胞株L-02，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。

1.2 主要試劑及儀器

注射用丹酚酸A(北京本草天源藥物研究院和正大青春寶藥業(yè)有限公司研制)；維生素E(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)；四氯化碳(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(上海申能德賽技術(shù)診斷有限公司)；大鼠層粘蛋白酶(LN)、透明質(zhì)酸酶(HA)ELISA試劑盒(上海卓康生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；小牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)；7020型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；AL204電子分析天平(瑞士METTLER公司)；紫外分光光度計(jì)DU800(美國(guó)BACKMAN公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸A對(duì)CCl4肝細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

1.3.1.1 造模與處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝細(xì)胞株L-02，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分成模型對(duì)照組、丹酚酸A高、低劑量組(終濃度分別為50 μg/mL和25 μg/mL)、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素E終濃度為2 mmol/L)和空白對(duì)照組，于37℃，5 %二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待正常肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，除空白對(duì)照組外，將培養(yǎng)板置于密閉容器內(nèi)，加入1.2 mL/L的CCl4，放入37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，造成肝細(xì)胞體外損傷模型。

1.3.1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

于96孔板中每孔加入20 μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.3.1.3 ALT、AST、LDH活性和SOD、MDA含量的測(cè)定

收集細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中的上清液，在7020全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定AST、ALT和LDH活性，同時(shí)，用胰蛋白酶消化貼壁的L-02細(xì)胞，收集細(xì)胞，并用PBS洗滌2次，破碎細(xì)胞后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定SOD活性和MDA含量。

1.3.2 丹酚酸A對(duì)肝纖維化模型大鼠的保護(hù)作用

1.3.2.1 分組與造模

取SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重200～220 g，32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(8只)與造模組(24只)，其中造模組大鼠背部皮下注射四氯化碳/橄欖油=2∶3的混合液，每周一和周五各注射1次。造模4周后，按體重將造模隨機(jī)分為模型對(duì)照組、丹酚酸A高、低劑量組，每組8只。丹酚酸A高、低組分別尾靜脈注射5 mg/kg、2.5 mg/kg丹酚酸A；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg；各組每日一次，連續(xù)給藥4周。

1.3.2.2 生化指標(biāo)的測(cè)定

給藥4周后，用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，迅速打開(kāi)腹腔，取腹主靜脈血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定血清SOD活性和MDA含量；ELISA法測(cè)定血清LN和HA的含量。

1.3.2.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

處死后取同一部位的肝臟組織，經(jīng)10%中性甲醛固定，脫水透明、石蠟包埋和切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A對(duì)CCl4損傷肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALT、AST、LDH活性和細(xì)胞存活率的影響

與空白對(duì)照組比，模型對(duì)照組培養(yǎng)上清液中的ALT、AST和LDH活性均明顯升高(P< 0.01)，而細(xì)胞存活率顯著下降(P< 0.01)。與模型對(duì)照組比，丹酚酸A高劑量組培養(yǎng)上清液中的ALT、AST和LDH活性均顯著降低(P< 0.01)，同時(shí)，丹酚酸A高、低劑量組和Vit E組細(xì)胞存活率亦均明顯提高(P< 0.01)(圖1)。

注：與空白對(duì)照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01；與模型對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

2.2 丹酚酸A對(duì)CCl4損傷肝細(xì)胞細(xì)胞裂解液SOD活性和MDA含量變化的影響

與空白對(duì)照組比，模型對(duì)照組肝細(xì)胞SOD活性顯著降低(P< 0.01)，MDA含量明顯升高(P< 0.01)；與模型對(duì)照組比，丹酚酸A高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組SOD活性均明顯升高(P< 0.05)，MDA含量均顯著降低(P< 0.05)(圖2)。

2.3 丹酚酸A對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠血清LN和HA含量的影響

與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組大鼠血清LN和HA含量均明顯升高(P< 0.01)；與模型對(duì)照組比，丹酚酸A高、低劑量組均有不同程度的降低血清LN和HA含量，其中高劑量組降低顯著(P< 0.05)(圖3)。

2.4 丹酚酸A對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組大鼠血清SOD活性顯著下降(P< 0.01)，MDA含量明顯升高(P< 0.01)；與模型對(duì)照組比，丹酚酸A高、低劑量組大鼠SOD活性均顯著升高(P< 0.05)，MDA含量均顯著降低(P< 0.05,P< 0.01)(圖4)。

注：與空白對(duì)照組比較，ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01；與模型對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：與正常對(duì)照組比，ΔP < 0.05，ΔΔP<0.01；與模型對(duì)照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：與正常對(duì)照組比，ΔP < 0.05，ΔΔP<0.01；與模型對(duì)照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

2.5 丹酚酸A對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織的影響及纖維化的分級(jí)

HE染色觀察顯示，正常對(duì)照組肝臟組織可見(jiàn)明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列整齊；模型對(duì)照組肝臟組織可見(jiàn)大量假小葉生成，大量肝細(xì)胞脂肪沉積變性，空泡狀間隙變大，中央靜脈和匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或點(diǎn)狀壞死、以及橋接壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯；與模型對(duì)照組比，丹酚酸A高、低劑量組肝臟組織假小葉數(shù)量已有顯著減少，肝細(xì)胞水腫，脂肪變性程度降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞有所恢復(fù)，且丹酚酸A高劑量組肝臟假小葉明顯消失，空泡狀結(jié)構(gòu)減少，肝細(xì)胞排列較整齊(封底圖5)。

模型對(duì)照組肝臟呈現(xiàn)重度纖維化，大量細(xì)胞壞死，形成明顯的纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有早期肝硬化癥狀；丹酚酸A高劑量組呈現(xiàn)輕度纖維化，肝小葉結(jié)構(gòu)大致保留，匯管區(qū)擴(kuò)大，嗜酸性小體出現(xiàn)，有少量纖維間隔；丹酚酸A低劑量組，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔明顯，細(xì)胞萎縮、壞死、消失，形成纖維化(封底圖5)。

3 討論

慢性肝臟疾病已構(gòu)成了一項(xiàng)全球性的挑戰(zhàn)問(wèn)題，但目前醫(yī)學(xué)界對(duì)這些疾病的治療效果有限，而且所有慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，最終肝功能衰竭，因此，尋找治療肝臟疾病和控制纖維化的治療新藥成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。CCl4致肝損傷是肝細(xì)胞氧化損傷經(jīng)典的模型，CCl4進(jìn)入體內(nèi)后可直接溶解肝細(xì)胞膜，經(jīng)肝細(xì)胞中細(xì)胞色素 P450依賴(lài)性混合功能氧化酶的代謝，可以生成活潑的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，這些物質(zhì)能夠啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，致使肝細(xì)胞損傷[5]。其中AST、ALT是反映肝細(xì)胞受損的一個(gè)重要指標(biāo)，ALT、AST主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶可滲出細(xì)胞膜，進(jìn)入胞外。AST也分布于線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損害嚴(yán)重時(shí)，線粒體內(nèi)AST釋放出細(xì)胞[6]。當(dāng)CCl4作用于肝細(xì)胞時(shí)，肝細(xì)胞損傷壞死，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞外轉(zhuǎn)氨酶的活性就會(huì)比正常狀態(tài)高1倍。乳酸脫氫酶(LDH)存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷或壞死后，LDH水平會(huì)大幅升高。本研究顯示，CCl4可誘導(dǎo)肝細(xì)胞存活率降低和細(xì)胞上清液AST、ALT和LDH水平的顯著升高，而加入丹酚酸A和維生素E則明顯抑制細(xì)胞上清液AST、ALT和LDH水平的升高和提高細(xì)胞存活率，表明丹酚酸A對(duì)CCl4所致的肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。同樣，在體研究亦顯示CCl4致大鼠肝纖維化后，肝臟組織大量假小葉生成、肝細(xì)胞脂肪沉積變性、空泡狀間隙變大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或點(diǎn)狀壞死、以及橋接壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，而丹酚酸A可逆轉(zhuǎn)或改善肝臟的病理形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)丹酚酸A具有保護(hù)肝細(xì)胞損傷的作用。

層粘蛋白(LN)在肝纖維化中的作用主要是連接基質(zhì)中的大分子成分，共同參與基底膜的形成及肝血竇的毛細(xì)血管化[7]。在肝纖維化早期，大量LN合成，同時(shí)，LN也可反映肝纖維化的進(jìn)展與嚴(yán)重程度。透明質(zhì)酸酶(HA)是ECM組分—糖胺多糖的成分之一，過(guò)量的HA將導(dǎo)致膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)量沉積，改變組織的彈力，是纖維化發(fā)生的重要基礎(chǔ)之一[8]。因此，HA和LN指標(biāo)被認(rèn)為是肝纖維化形成的血清標(biāo)記物[9]。本結(jié)果顯示，丹酚酸A能顯著抑制CCl4所致大鼠血清LN和HA水平的升高，提示丹酚酸A能抑制膠原纖維在肝臟中的沉積。

眾所周知，氧化損傷可誘導(dǎo)肝纖維化，自由基如H2O2，O·2-和·OH均與肝纖維發(fā)生和病理進(jìn)展有關(guān)。自由基和生物分子反應(yīng)產(chǎn)物能促進(jìn)吞噬細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的活動(dòng)[10]。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化能刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)促進(jìn)膠原蛋白的合成[9]?？梢?jiàn)，氧化應(yīng)激主要通過(guò)增加肝星狀細(xì)胞活化和膠原合成促進(jìn)肝纖維化的形成。超氧化歧化酶(SOD)是主要的抗氧化酶之一，能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻斷自由基的毒性作用，清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。氧自由基損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，生成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，最終產(chǎn)物是丙二醛(MDA)，MDA含量?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[11]，并發(fā)現(xiàn)MDA可劑量依賴(lài)性的促進(jìn)HSC的增殖。劉成等[12]研究表明丹酚酸A能降低損傷肝細(xì)胞中MDA含量，抑制HSC的增殖。本研究從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)丹酚酸A能提高損傷后肝細(xì)胞和機(jī)體血清SOD活性，降低MDA含量，表明丹酚酸A可通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作用，抑制HSC活化和膠原合成，從而抑制肝纖維化的發(fā)展。

綜上所述，丹酚酸A具有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減輕肝細(xì)胞損傷程度和抑制纖維化的發(fā)展。其作用與其通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，抑制HSC活化和膠原合成，從而抑制肝纖維化的發(fā)展有關(guān)。

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