陳 亮，潘永明，朱科燕，陳方明，徐孝平，陳民利

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

豬和人在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)制等方面極其相似，尤其是在心血管方面與人類相似[1]，而巴馬小型豬是我國特有的以廣西巴馬香豬為原始種群，經(jīng)多世代近交選育出的適于實(shí)驗(yàn)用的小型豬品系，已廣泛應(yīng)用于皮膚燒傷、心血管疾病、臟器移植等人類疾病模型的建立以及藥物開發(fā)的研究。目前對于巴馬小型豬的基礎(chǔ)生理指標(biāo)方面研究已有血液生化[2]、束縛狀態(tài)下心電指標(biāo)[3]、麻醉狀態(tài)下創(chuàng)傷性血壓[4]等，但是在許多毒理藥理實(shí)驗(yàn)中均要求對動(dòng)物的生理指標(biāo)進(jìn)行較長時(shí)間不間斷的監(jiān)測，若要進(jìn)行長時(shí)程研究，由于受到實(shí)驗(yàn)條件的制約，則需要對動(dòng)物進(jìn)行麻醉、束縛、導(dǎo)線連接等一些操作，這些操作會(huì)引起血壓、心率和體溫等生理參數(shù)的變化，降低實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性[5]。因此，本文采用大動(dòng)物無創(chuàng)生理信號(hào)遙測技術(shù)，既避免了麻醉、固定等操作，又克服長時(shí)間觀察的難題，同時(shí)還更加有利于改善和提高動(dòng)物福利[6]；通過觀察巴馬小型豬清醒自由狀態(tài)下的24 h心電、血壓、呼吸、活動(dòng)等指標(biāo)，為將來巴馬小型豬在藥理毒理試驗(yàn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)六月齡巴馬小型豬6只，雄性，體質(zhì)量為16～18 kg，由上海市南匯區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場提【SCXK(滬)2012-0013】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0184】，環(huán)境溫度為22±1℃，相對濕度為45%～65%。飼喂全價(jià)營養(yǎng)飼料和自由飲水，12h/12h明暗交替，所有小型豬按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并在適應(yīng)性恢復(fù)8周后開始正式試驗(yàn)。

1.2 主要儀器及試劑

EMKA 大動(dòng)物無創(chuàng)生理信號(hào)遙測系統(tǒng)，法國EMKA 公司；VAP血管通路，產(chǎn)品編號(hào)SLAAC-7S，批號(hào)102412S，美國Norfolk醫(yī)藥。

1.3 遙測方法建立

將6只巴馬小型豬禁食12 h后，肌注0.1 mL/kg速眠新II注射液麻醉后，仰臥位固定，右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)部位進(jìn)行剃毛消毒，定位后切口，分離淺表股動(dòng)脈，將分離后的淺表股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用手術(shù)線結(jié)扎，近心端用無損血管夾夾閉，然后在血管中間上部采用穿刺引導(dǎo)針刺入，植入7F的VAP血管通路7～10 cm，直至股動(dòng)脈總支，縫合和結(jié)扎固定血管。最后在小型豬頸背部行一2 cm切口，將VAP血管通路導(dǎo)管引導(dǎo)至背部切口位置，并固定Port。植入后，用生理鹽水沖洗VAP血管通路2遍，每次2 mL，并在管內(nèi)注射含有100 IU/mL的肝素鈉及80000 IU/mL青霉素生理鹽水溶液1～2 mL，注意肝素僅封閉管路不注入體內(nèi)，最后縫合各切口部皮膚；術(shù)后完畢，注射鹿醒寧后放回籠內(nèi)正常飼養(yǎng)，期間每天注射青霉素溶液80萬IU，連續(xù)5 d。

術(shù)后2周后，將小型豬的胸腹部毛剃除，分別在左、右兩側(cè)第6 肋間與胸骨的連接處和第1對乳頭下緣的皮膚表面粘上心電電極膜，并接上心電電極；然后穿上內(nèi)衣，并將呼吸帶固定在胸部內(nèi)衣上，然后，通過VAP血管通路，將EMKA血壓換能器連接豬背部皮下的Port；隨后給小型豬穿上外衣，將心電電極、呼吸電極、血壓換能器與EMKA PACK 連接，放置于外套的PACK袋中，連接完畢后，放回籠內(nèi)。所有信號(hào)記錄于EMKA Iox軟件中，其中心電導(dǎo)聯(lián)的采樣頻率為500 Hz/s，活動(dòng)采樣頻率為100 Hz/s，呼吸采樣頻率為200 Hz/s，血壓采樣頻率為200 Hz/s，連續(xù)監(jiān)測24 h。白天時(shí)間為8: 00～20: 00，黑夜時(shí)間為20: 00～ 8:00。

1.4 數(shù)據(jù)采集和分析

連續(xù)觀察分析24 h巴馬小型豬的II導(dǎo)心電圖、活動(dòng)、呼吸情況、血壓，并用ECG-Auto分析軟件進(jìn)行各指標(biāo)分析，同時(shí)比較巴馬小型豬晝夜生理指標(biāo)的變化。

1.5 觀察指標(biāo)

巴馬小型豬心電指標(biāo)：心率(HR)、PR間期、QRS間期、QT間期；血壓指標(biāo)：收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均壓(MBP)；活動(dòng)指標(biāo)；呼吸頻率；下降率(reduction rate)：(全天最高值-全天最低值)/全天最高值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行T檢驗(yàn)，以P< 0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 巴馬小型豬24 h心電分析

由表1與圖1A、圖1B、圖1C可知，巴馬小型豬白晝平均心率為76.22次/min，黑夜平均心率為67.03次/分，白晝平均PR間期為109.97 ms，黑夜平均PR間期為112.32 ms，白晝平均QRS間期為42.72 ms，黑夜平均QRS間期為44.01 ms，白晝心率顯著高于黑夜心率(P< 0.01)，白晝PR間期與白晝QRS間期顯著低于黑夜(P< 0.05，P< 0.01)。白晝心率最高點(diǎn)以及白晝PR間期最低點(diǎn)、白晝QRS間期最低點(diǎn)均位于上午8:00～9:00、下午14:30～15:30，期間為飼養(yǎng)人員活動(dòng)以及喂食階段，白晝心率最低點(diǎn)位于13:00左右，夜晚心率持續(xù)下降，直至早上6:00左右降至最低點(diǎn)，夜晚心率下降率為35.82%。巴馬小型豬PR間期在進(jìn)入夜間后逐漸上升，直至早上7:00左右升至最高點(diǎn)，白晝PR間期下降率為15.92%。巴馬小型豬QRS間期在進(jìn)入夜間后亦逐漸上升，直至早上4:00～6:00左右升至高點(diǎn)，白晝QRS間期下降率為8.86%。由表1與圖1D可知，巴馬小型豬白晝平均QT間期為380.37 ms，夜間平均QT間期為389.24 ms，白晝QT間期顯著低于黑夜QT間期(P< 0.01)。白晝QT間期最低點(diǎn)位于下午14:00，期間為飼養(yǎng)人員活動(dòng)以及喂食階段，以及17:00至19:00之間，進(jìn)入夜晚后巴馬小型豬QT間期逐漸延長，直至早上7:30～8:00上升至最高點(diǎn)，白晝QT間期下降率為10.66%。

2.2 巴馬小型豬24 h動(dòng)態(tài)血壓分析

由表2與圖2可知，巴馬小型豬白晝收縮壓、舒張壓、平均壓都顯著高于夜間(P< 0.01)。

白晝平均收縮壓為129.57 mmHg，夜間平均收縮壓為122.81 mmHg，白晝收縮壓峰值出現(xiàn)在下午14:30左右，峰值為143.78 mmHg，夜間收縮壓谷底期出現(xiàn)在上午6:30左右，谷值為115.18 mmHg，夜間收縮壓下降率為19.89%。白晝平均舒張壓為96.75 mmHg，夜間平均舒張壓為92.65 mmHg，白晝舒張壓峰值出現(xiàn)在下午14:30左右，峰值為109.51 mmHg，夜間舒張壓谷底期出現(xiàn)在上午6:00左右，谷值為88.65，夜間舒張壓下降率為19.05%。白晝平均壓為111.73 mmHg，夜間平均壓為106.19 mmHg，白晝平均壓峰值出現(xiàn)在下午14:30左右，峰值為124.89 mmHg，夜間平均壓谷底期出現(xiàn)在上午7:00左右，谷值為100.73 mmHg，夜間平均壓下降率為19.35%。

表1 巴馬小型豬24 h、白晝、黑夜心電指標(biāo)比較(n=6)

注：白晝與黑夜比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

表2巴馬小型豬24 h、白晝、黑夜血壓比較(n=6)

Tab.2Comparison of 24 h，daytime and dark blood pressure in Bama minipigs(n=6)

注：白晝與黑夜比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：白晝與黑夜比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：白晝與黑夜比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

2.3 巴馬小型豬24 h呼吸活動(dòng)情況分析

由圖3可知，巴馬小型豬在白晝的活動(dòng)情況與呼吸頻率都要顯著高于夜間(P< 0.01)。巴馬小型豬在上午8:00～9:00，下午2:00～3:00活動(dòng)情況最為頻繁，呼吸頻率也最快。進(jìn)入夜間后，活動(dòng)減少，呼吸頻率也逐漸降至最低。

3 討論

遙測技術(shù)在國內(nèi)目前應(yīng)用正處于起步階段，但在國外早已應(yīng)用相當(dāng)廣泛，2009年Cools F等[7]已利用遙測技術(shù)，對Beagle犬長期進(jìn)行24 h心電觀察，對Beagle犬的心率失常發(fā)生率進(jìn)行監(jiān)測，目前國外較前沿的遙測技術(shù)，還能長期同時(shí)精確監(jiān)控動(dòng)脈血流量，血壓和心電圖等[8]，遙測技術(shù)目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中減少動(dòng)物應(yīng)激的最有效手段之一。通過遙測技術(shù)，Stubhan M[9]等還將植入子植入哥根廷小型豬，獲得哥根廷小型豬清醒自由狀態(tài)下的動(dòng)脈血壓以及心室內(nèi)壓等心血管數(shù)據(jù)，本文方法學(xué)上與上述實(shí)驗(yàn)有一定共同點(diǎn)，只是心室內(nèi)壓由于對植入導(dǎo)管要求較高，本試驗(yàn)尚未進(jìn)行嘗試，需待今后繼續(xù)研究。本課題組前期已利用無創(chuàng)遙測技術(shù)來觀察運(yùn)輸應(yīng)激對 Beagle犬部分生理指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)Beagle犬心率、RR間期、QT間期、活動(dòng)、皮膚溫度、呼吸均具有明顯的晝夜節(jié)律變化[6]。本試驗(yàn)擬通過心電、血壓、呼吸、活動(dòng)等指標(biāo)的24 h監(jiān)測數(shù)據(jù)，評估巴馬小型豬在清醒自由狀態(tài)下上述生理指標(biāo)的晝夜變化，以及人員活動(dòng)對這些指標(biāo)的影響。

本文通過遙測技術(shù)，對巴馬小型豬進(jìn)行24 h心電觀察，成年6月齡巴馬小型豬白晝平均心率在76.22次/分，黑夜平均心率為67.03次/分，白晝心率顯著高于黑夜心率(P< 0.01)；從呼吸和活動(dòng)情況來看，與心率變化情況一致，說明巴馬小型豬心率、呼吸、活動(dòng)具有明顯在晝夜節(jié)律變化，且白天為活動(dòng)頻繁期，夜晚為休息期。9:00～13:00、18:00～24:00為穩(wěn)定休息期，1:00～6:00為深度睡眠期，期間心率、呼吸頻率降至最低，活動(dòng)幾乎停止。通過對PR間期、QRS間期觀察，發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬白晝PR間期、QRS間期顯著低于黑夜(P< 0.05，P< 0.01)；白晝PR間期、QRS間期最低點(diǎn)位于上午8:00～9:00以及下午14:30～15:30，PR間期、QRS間期整理變化幅度不大，只是飼養(yǎng)人員活動(dòng)以及喂食階段有少量的下降，說明實(shí)驗(yàn)人員活動(dòng)以及喂食對PR間期、QRS間期影響較小，夜晚PR間期上升，直至早上7:00左右升至最高點(diǎn)，巴馬小型豬夜晚QRS間期上升，直至早上4:00～6:00左右升至高點(diǎn)，深睡眠階段PR間期與QRS間期都有一定程度延長，但蘇醒階段PR間期要早于QRS間期的恢復(fù)；人員活動(dòng)對于QT間期變化趨勢影響亦不明顯，QT間期上午8:00時(shí)最長，而后逐漸縮短，至下午17:00～19:00左右降至最短，在進(jìn)入夜晚后QT間期開始延長，直至上午八點(diǎn)最高點(diǎn)，說明巴馬小型豬在白晝清醒活動(dòng)狀態(tài)下，QT間期是逐漸縮短的，而夜晚逐漸由活動(dòng)較少進(jìn)入休息甚至睡眠的情況下，QT間期逐漸延長。相比較于吊床束縛狀態(tài)下[3]測定的巴馬小型豬心率124.57次/min，PR間期、QRS間期與QT間期分別為80 ms、40 ms、290 ms，本試驗(yàn)通過遙測方法所測得心電數(shù)據(jù)除QRS間期與束縛狀態(tài)下所測相近，其余均有一定差距，心率更慢，PR間期與QT間期更長，而這些差距我們認(rèn)為是束縛所帶來的應(yīng)激所引起的，遙測技術(shù)能更好的避免應(yīng)激，還原數(shù)據(jù)真實(shí)性，保障動(dòng)物福利。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，巴馬小型豬白晝收縮壓、舒張壓、平均壓都顯著高于夜間(P< 0.01)，均有顯著的晝夜節(jié)律變化。白晝收縮壓、舒張壓、平均壓峰值都出現(xiàn)在下午14:30左右，夜間收縮壓、舒張壓、平均壓谷底期都出現(xiàn)在上午6:00～7:00左右，巴馬小型豬的血壓變化和心率變化的趨勢基本相同。此外值得關(guān)注的是血壓最高點(diǎn)14:30以及血壓最低點(diǎn)6:00～7:00，通過這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的研究，為實(shí)驗(yàn)人員實(shí)驗(yàn)觀察和給藥時(shí)間的確定提供了參考依據(jù)。另外前文提到Stubhan M[8]等通過遙測方法測得哥根廷小型豬收縮壓、舒張壓、平均壓分別為123、88、105，與本試驗(yàn)測得巴馬小型豬收縮壓、舒張壓、平均壓分別為126.05、94.62、108.87相比，巴馬小型豬正常血壓略高于哥根廷小型豬。

本文利用遙測技術(shù)觀察到的巴馬小型豬心率、血壓、呼吸、活動(dòng)等指標(biāo)均有明顯的晝夜節(jié)律變化，心率、血壓、呼吸頻率、活動(dòng)頻率等指標(biāo)白晝階段均高于夜晚階段，與小型豬正常的生理周期特性所吻合。利用遙測技術(shù)可以對清醒自由狀態(tài)下巴馬小型豬心電、血壓、呼吸、活動(dòng)等進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，能真實(shí)的反應(yīng)小型豬在24 h內(nèi)上述生理指標(biāo)的變化規(guī)律，為巴馬小型豬在藥理毒理研究中的應(yīng)用提供參考。同時(shí)為開發(fā)我國特有資源，推進(jìn)巴馬小型豬實(shí)驗(yàn)化，并且有助于提高藥物安全評價(jià)效率，豐富試驗(yàn)體系，降低試驗(yàn)成本。

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