梁 成，莊躍宏，鄭和平，吳劍威，馬 雷，謝志平

(1.福建醫(yī)科大學福總臨床醫(yī)學院(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)比較醫(yī)學科，福州 350025;2.福建醫(yī)科大學人體解剖與組織胚胎學系，福州 350108)

腫瘤切除、燒傷，特別是交通傷等引起的較大面積軟組織缺損，面積往往超過單個軸形皮瓣的覆蓋能力，臨床醫(yī)生根據(jù)缺損修復的需要，將皮瓣擴大切取，超出解剖供區(qū)的限制，甚至到達遠鄰的潛力供區(qū),這就是所謂的跨區(qū)皮瓣[1]。跨區(qū)皮瓣切取后，皮瓣需跨過血管體之間的吻合血管，也就是Taylor[2]認為的choke血管向皮瓣遠端供血。生理狀態(tài)下吻合血管管徑極其細小，是跨區(qū)皮瓣切取后血流以足夠的速率與量通往遠端的最大障礙，因此皮瓣能完全存活的關鍵在于不同區(qū)域間的吻合血管是否都能擴張成為真性吻合。因此，對跨區(qū)皮瓣血管體間的choke血管在皮瓣切取后的生物學變化進行深入研究，對提高跨區(qū)皮瓣的存活率有重要的意義。目前，幾種研究choke血管的動物模型，均存在較明顯的缺陷[3-5]。本研究在觀察小鼠耳的血管分布情況后，在小鼠耳上切取跨三區(qū)皮瓣，不僅成功觀察到吻合區(qū)血管的形態(tài)變化過程，也得到一穩(wěn)定的皮瓣壞死模型，為以后進一步研究血管擴張機制及遴選促皮瓣存活藥物的理想動物模型奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 可編程數(shù)控二維精密圖像采集系統(tǒng)設計

可編程數(shù)控二維精密圖像采集系統(tǒng)(圖1)。包括：十字滑臺、數(shù)控兩軸運動控制器、步進電機驅動器、步進電機、電源、動物承載臺、體視顯微鏡，數(shù)碼相機。①十字滑臺：精度0.01 mm；②控制器：可編輯程序；③動物承載臺(圖2)：載物臺的中間鏤一直徑為2 cm的圓孔，主要用來增加透光性。圓孔上粘貼一塊(3×2×0.4)cm的小有機玻璃板，主要用于放置鼠耳。在小有機玻璃板的兩側粘兩小有機玻璃條，比中間小有機玻璃板高1 mm便可，用于放置載玻片壓平鼠耳，但又不至于阻斷鼠耳血供；④體視顯微鏡(moticam 1300)；⑤數(shù)碼相機(OLYMPUS SZ-16)。

注：1. 置耳臺；2.玻片臺；3，玻片。

由于滑臺的高度與軸長限制，與顯微鏡物距無法匹配，決定了動物承載臺和滑臺不能直接組合置于物鏡下。因此，必須要做一個足夠面積的有機玻璃托板，將動物承載臺連接并間接固定在滑臺上，通過滑臺的往復運動,帶動動物承載臺運動，從而巧妙地實現(xiàn)鼠耳按“弓”型路線準確步進。

1.2 實驗動物

30只清潔級ICR小鼠，雄性，體重25～30 g，鼠耳完整無皮膚病變或外傷，由福建醫(yī)科大學動物中心【SCXK(閩)2012-0001】提供；飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科屏障環(huán)境【SYXK(閩)2013-0004】，環(huán)境溫度22±1℃，相對濕度40%～65%。

1.3 模型建立

用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)將小鼠麻醉成功后，商業(yè)人用脫毛膏鼠耳脫毛并用流水沖凈，體視顯微鏡下(×25)觀察鼠耳的血管分布情況。根據(jù)觀察結果，用眼科剪從尾側向頭側剪斷小鼠耳基底部尾側2/3，保留頭側1/3，形成以耳前動靜脈為蒂內(nèi)含三個血管體、二個choke區(qū)的跨區(qū)供血耳瓣。

1.4 圖像采集

小鼠麻醉成功后，側臥置于圖像采集系統(tǒng)的動物承載臺上，鼠耳蓋上載玻片，盡量展平鼠耳。調節(jié)體視顯微鏡物鏡并固定為25倍；設置步進參數(shù)，使動物承載臺在X、Y軸上步進距離0.25 cm/次,間隔時間為5 s，行進路線為“弓”型。動物承載臺每移動一次采集一次圖像，每只小鼠整耳大概需采集10張圖像。圖像采集時間點為耳瓣切取后0,1,2,3,4,5,6,7,10,14,21,30 d。

1.5 數(shù)據(jù)測量及統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 鼠耳的血管分布

鼠耳面積約為1.5×1.3 cm，厚度約為0.3 mm，透光度好。在體視顯微鏡下清晰可見3條血管束：尾側血管束、中間血管束及頭側血管束。每個血管束均有一條動脈與相伴行的靜脈，動脈直徑為0.2～0.5 mm，靜脈直徑為0.9～2.1 mm。頭側血管束進入鼠耳基底部后，沿著鼠耳前側緣走行。尾側血管束在整個走形過程中分支較少，末端與中間血管體的內(nèi)側分支吻合。中間血管體在進入基底部后往往分為三大支，中間支垂直向上走行，內(nèi)側支往內(nèi)側走行，與頭側血管體吻合；尾側血管體在進入基底部前往往分為兩支，兩支一并進入耳體，與中間血管外側分支往往有細小吻合。頭側血管體與尾側血管體分別約供應1/4的耳體，中間血管體約供應1/2的耳體(圖3A)。

2.2 耳瓣內(nèi)血管管徑變化及壞死面積

術后即刻，耳瓣透光性最佳，動靜脈均清晰可見。術后24 h，便可以觀察到第三血管體所供應的區(qū)域出現(xiàn)部分壞死的征象：高倍鏡(×100)下可見血管內(nèi)無血液流動，組織脫水，血管周圍出現(xiàn)眾多紅斑，為溢出的紅細胞。術后4 d，耳瓣水腫較為厲害，致使其透光性有所降低，在顯微鏡下耳瓣整體較為暗淡，靜脈依然較為清晰，但動脈觀察則有點困難。術后5 d，耳瓣壞死面積趨于穩(wěn)定，壞死率為(15±7)%(彩插5圖3B )。耳瓣術后，頭側血管體與中間血管體之間的choke動、靜脈的管徑出現(xiàn)快速擴增，兩者都在第10天左右達到最大，choke靜脈管徑最高峰可到達原來的(3.9±0.5)倍，choke動脈管徑最高峰可達到原來的(3.5±0.7)倍。10 d后，choke靜脈管徑開始減小，21 d后逐漸平穩(wěn)，而choke動脈管徑于術后10 d左右開始平穩(wěn)，之后無明顯減小(圖4)。在中間血管體與尾側血管體之間擴張的choke血管數(shù)量及幅度多小于第一choke區(qū)，在少數(shù)出現(xiàn)較明顯擴張的耳瓣中，第三血管體所支配的區(qū)域壞死率出現(xiàn)明顯降低(彩插5圖5)。耳瓣切取后30 d內(nèi)，很多小鼠鼠耳上可以觀察到第二血管體內(nèi)的靜脈除了與頭側血管體直接相連的內(nèi)側分支管徑增加后處于一個較平穩(wěn)的狀態(tài)，其它兩個分支內(nèi)的靜脈在耳瓣切取后4 d左右，由于靜脈回流障礙出現(xiàn)的靜脈被動擴張，而后期耳瓣皮瓣血供重構穩(wěn)定后，擴張的靜脈明顯萎縮、退化，管徑比耳瓣切取前減小。皮瓣會出現(xiàn)一個明顯的靜脈回流軸向，尾側血管體內(nèi)的未壞死部分的靜脈在耳瓣基底部通過細小的靜脈連到第二血管體的基部，后通過第二血管體的內(nèi)側分支直接到內(nèi)側血管體。

圖4 choke血管管徑變化趨勢

3 討論

3.1 跨區(qū)供血皮瓣的概念及本實驗結果對其存活機制的提示

人體皮膚的每一支動脈均有一個明確的供血范圍，即解剖學供區(qū)。每一個解剖學供區(qū)與其周圍相鄰動脈之間均有豐富的吻合，Taylor等[2]將這種吻合稱為choke血管。一側血管被切斷或阻斷時，其管道內(nèi)血壓下降，此時，解剖學供區(qū)血管內(nèi)的血流就會跨越原來的吻合部位(choke vessels)向遠端供血。這種緊鄰解剖學供區(qū)的擴張部分被稱之為血流動力學供區(qū)(dynamic territory)。在跨越動力學供區(qū)的基礎上，若再繼續(xù)向遠鄰的供區(qū)延伸，則稱其為潛力供區(qū)(potential territory)。這表明：可將皮瓣從解剖學供區(qū)向緊鄰的動力學供區(qū)擴張切取，若再繼續(xù)向遠鄰的潛力供區(qū)延伸，則可得到更大的皮瓣[1]，這就是所謂的跨區(qū)供血皮瓣。臨床經(jīng)驗及動物實驗提示跨區(qū)皮瓣切取后，動力供區(qū)往往能夠順利存活，而皮瓣壞死最容易出現(xiàn)在動力供區(qū)與潛力供區(qū)之間choke區(qū)及其遠端潛力供區(qū)部分，其原因有待深入研究[7]。

耳瓣切取后，耳瓣內(nèi)靜脈在早期均出現(xiàn)明顯的擴張，而后期很多擴張靜脈又出現(xiàn)回縮，管徑較小，甚至消失，提示耳瓣內(nèi)靜脈早期的擴張可能屬于被動擴張，可能是靜脈回流瘀滯的一個表現(xiàn)。皮瓣切取后7 d左右，慢慢就能看到耳瓣內(nèi)一個明顯的靜脈回流軸向：尾側血管體內(nèi)的未壞死部分的靜脈在耳瓣基底部通過細小的靜脈連到第二血管體的基部，而后通過第二血管體內(nèi)側分支直接到頭側血管體，耳瓣內(nèi)靜脈似乎都是選擇以最短距離回到蒂部。而皮瓣動脈沒有明顯的管徑增加又回縮的現(xiàn)象，提示動脈擴張早期可能是因為失神經(jīng)或者代謝產(chǎn)物積累、缺氧等原因造成血管的擴張，只是彈性的擴張期，之后出現(xiàn)動脈壁細胞的增值，屬于主動增值。

3.2 耳瓣模型的優(yōu)缺點

耳瓣模型與目前文獻上報道的用于跨區(qū)供血皮瓣研究的動物模型相比有以下優(yōu)點：⑴耳瓣切取后，耳瓣內(nèi)整個血管的形態(tài)學變化可在活體上長時間觀察，明顯優(yōu)于文獻上報道的在大鼠或兔子背部切取皮瓣，再按照時間點分批處死動物進行血管造影的方法。目前文獻上報道的動物皮窗模型是另外一種能夠實現(xiàn)對皮瓣切取后皮瓣內(nèi)血管形態(tài)學活體長時間觀察的方法[3-4]。小鼠耳瓣模型與皮窗模型相比有較明顯的優(yōu)點: ①不用安裝皮窗，避免了很大的一個干擾因素；②避免皮下組織直接暴露于皮下，大大減小動物的感染率和致死率，提高模型的成功率；③操作方便，不用安裝皮窗，不用縫皮，與每只大鼠皮窗模型至少需30 min制作相比，耳瓣模型從耳瓣制作到照片合成完畢只需5～8 min；⑵耳瓣內(nèi)壞死與成活的組織界限清晰可見，耳瓣壞死率容易精確計算。我們認為該模型是最好的用于篩選具有血管活性，能促進皮瓣存活的藥物；⑶小鼠耳成對，可互相作為對照組。小鼠耳瓣模型作為跨區(qū)皮瓣模型最大的缺點在于鼠耳屬于復合組織，除了皮膚還有軟骨，與單純的皮瓣相比，其生理可能存在不同。

3.3 鼠耳模型建立要點

耳瓣模型的制作過程中需注意以下兩點：①當耳瓣切取后，由于疼痛，小鼠具有相互啃咬的天性，不恰當?shù)娜︷B(yǎng)會導致小鼠相互啃咬耳瓣，并增加小鼠耳瓣感染可能性，使試驗功虧一簣，本模型中必須保證所有小鼠單獨飼養(yǎng)；②不恰當?shù)姆胖蒙w玻片會壓癟甚至截斷鼠耳中正常的血流，影響試驗的統(tǒng)計，所以兩側的架高條的高度必須適中，給蓋玻片和鼠耳留有一定空間，既能保證鼠耳鋪平又能保證血流通暢。

綜上所述，本課題建立的鼠耳模型能清晰的對跨區(qū)皮瓣微循環(huán)的形態(tài)學變化進行長時間的活體觀察，并具有穩(wěn)定壞死率，不失為研究血管擴張機制及遴選促皮瓣存活藥物的理想動物模型。

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