紀(jì)海茹， 孔 維， 孔令偉， 趙淑敏△， 孔祥玉△， 王 偉

( 1承德醫(yī)學(xué)院脊髓損傷與修復(fù)研究室，河北 承德 067000； 2南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000)

中風(fēng)是目前導(dǎo)致死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因，復(fù)雜的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了腦缺血時(shí)神經(jīng)元損傷的主要過程，其中細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的病理生理改變直接影響了神經(jīng)組織的損傷程度[1]。神經(jīng)血管單元的結(jié)構(gòu)改變，如血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性發(fā)生變化，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的劇變，導(dǎo)致血管源性腦水腫，加重腦損傷[2]。腦缺血時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶類通過降解細(xì)胞外基質(zhì)參與了BBB的破壞和血管源性腦水腫的過程，其中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)居主導(dǎo)地位[3]。觀察腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)后MMP-9表達(dá)水平的變化對(duì)評(píng)價(jià)BBB功能的變化具有重要意義[4]。

丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)在臨床主要應(yīng)用于輕、中度急性缺血性腦卒中[5]，對(duì)CIRI有肯定的治療效果[6]，但對(duì)CIRI防護(hù)作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)將其預(yù)防性應(yīng)用于CIRI大鼠，探討其對(duì)腦保護(hù)的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

丁苯酞軟膠囊購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；伊文思藍(lán)購(gòu)自TCI；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；MMP-9Ⅰ抗購(gòu)自宜康生物技術(shù)有限公司；RNasio Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

2 動(dòng)物分組、給藥方法及模型制備

成年SPF級(jí)雄性SD大鼠150只，體重260～280g，購(gòu)于北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，完全隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(sham組)、模型組(IR組)、NBP預(yù)處理低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預(yù)處理中劑量組(NBPⅡ組)和NBP預(yù)處理高劑量組(NBP Ⅲ組)，NBPⅠ、Ⅱ和Ⅲ組分別給予NBP 20、40和80 mg/kg，sham組和IR組給予等體積的生理鹽水。全部大鼠于造模前7 d開始灌胃給藥，每天1次。

末次灌胃24 h后，IR組和NBP各組參照Z(yǔ)ea 等[7]的方法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，不插入線栓。術(shù)后單籠飼養(yǎng)并注意保暖。缺血2 h后將栓線抽提至頸外動(dòng)脈殘端內(nèi)行再灌注，再灌注24 h后作相應(yīng)處理。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1腦水腫程度測(cè)定 采用干濕重法。各組均取6只大鼠麻醉后迅速取腦，分離出右側(cè)大腦，置于電子天平稱其濕重后，放到100 ℃烤箱中烤至恒重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.2BBB通透性測(cè)定 采用伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)作為示蹤劑監(jiān)測(cè)血腦屏障損傷程度的方法。每組取6只大鼠處死前1 h經(jīng)尾靜脈注入2%的EB(4 mL/kg)，大鼠皮膚、球結(jié)膜等變藍(lán)表示注入成功。1 h后經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水直至右心房流出清亮液體，快速取缺血側(cè)腦組織稱濕重后放入5 mL甲酰胺溶液中，54 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，1 000 r/min離心5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定其630 nm處的A值。甲酰胺溶液作為空白比色。腦組織EB含量(μg/g)=待測(cè)樣品EB含量(mg/L)×甲酰胺容量(mL)/腦濕重(g)。

3.3電鏡觀察血腦屏障結(jié)構(gòu)的變化 大鼠麻醉后，經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水200 mL，待右心耳流出清亮液體時(shí)，再用2%戊二醛和4%多聚甲醛混合液灌注固定。取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，常規(guī)透射電鏡樣品制備，半薄切片選區(qū)定位，超薄切片(片厚60 nm)鈾、鉛雙染，透射電鏡下觀察并攝片。

3.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá)水平 采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。大鼠麻醉后，經(jīng)左室快速灌注生理鹽水200 mL，隨后先快后慢地灌注4%多聚甲醛250 mL左右，快速斷頭取腦，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，以5 mm厚度連續(xù)切片，切片經(jīng)60 ℃烤片2 h后依次脫蠟、脫水，高壓鍋行抗原修復(fù)2 min后冷卻至室溫；PBS沖洗2次，每次5 min， 3% H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗2次，每次5 min，滴加山羊封閉血清，室溫孵育10 min后傾去；滴加1∶200的MMP-9Ⅰ抗，室溫孵育2 h；PBS沖洗3次，每次5 min，擦干切片周圍水分后，滴加Ⅱ抗，37 ℃溫箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min，擦干切片周圍水分后，滴加SP復(fù)合物即鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，37 ℃溫箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色3～5 min，水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染30 s，分化水洗，氨水返藍(lán)，脫水透明后中性樹膠封片。顯微鏡觀察，MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)為包膜和胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒。采用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Version 1.0)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值，行半定量分析。平均灰度值與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈反比。

3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)MMP-9 mRNA表達(dá) 根據(jù)GenBank中MMP-9 的基因序列，以β-actin為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)合成引物。各引物的序列分別為：MMP-9的上游引物為5′-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3′，下游引物為5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3′；β-actin的上游引物為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物為5′ -GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。根據(jù)TaKaRa公司提供的實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒采用SYBR Green法對(duì)MMP-9 的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定?？偡磻?yīng)體系為25 μL，包括Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，放入實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火51 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40，設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴(kuò)增和引物二聚體的出現(xiàn)。用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的表示，不同組間的均數(shù)比較用單因素方差檢驗(yàn)，各組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NBP預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠腦組織含水量的影響

與sham組比較，IR組大鼠腦組織含水量顯著增加(P<0.01)；與IR組比較，NBP預(yù)處理組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P<0.01)，且NBPⅡ、Ⅲ組較Ⅰ組減少更明顯(P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Water content alterations in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham;## P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP I .

2 NBP預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠BBB通透性的影響

IR組大鼠的BBB通透性較sham組顯著增高(P<0.01)；NBP各組大鼠的BBB通透性較IR組均顯著降低(P<0.01)，且NBPⅡ、Ⅲ組比Ⅰ組降低更為顯著(P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間差異不明顯(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. BBB permeability alterations in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP Ⅰ.

3 電鏡下觀察NBP預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠BBB形態(tài)學(xué)的影響

Sham組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核膜、核仁形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)密度均一，內(nèi)皮細(xì)胞基膜清晰，厚薄均勻，緊密連接結(jié)構(gòu)完好。IR組毛細(xì)血管明顯變形，管腔狹窄，血管周圍見大片電子空白區(qū)，內(nèi)皮細(xì)胞大量溶解，殘存的線粒體空泡變性，多處基膜片狀溶解、斷裂，緊密連接融合、擴(kuò)張。NBP各組均有不同程度的改善，NBPⅠ組血管周圍仍可見電子空白區(qū)，毛細(xì)血管基膜有溶解、斷裂現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性，緊密連接融合、擴(kuò)張；NBPⅡ、Ⅲ組的情況較Ⅰ組有明顯改觀，見圖3。

Figure 3. BBB ultrastructure alterations in the rats with different treatments (×20 000).

4 NBP預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

IR組的MMP-9蛋白表達(dá)平均灰度值(139.49±5.53)明顯低于sham組(179.52±6.35;P<0.01)；NBP各組MMP-9蛋白的表達(dá)平均灰度值較IR組均有不同程度增高(均P<0.01)，且NBPⅡ組(162.22±3.76)、NBPⅢ組(166.69±6.85)比NBPⅠ組(151.32±3.83)增高更為顯著(P<0.05)，但是NBPⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. The protein expression of MMP-9 in the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200).

5 NBP預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

Sham組MMP-9有微量表達(dá)；IR組MMP-9的表達(dá)較正常組明顯升高(P<0.01)，NBP各組MMP-9含量均減少，且NBPⅡ、Ⅲ組比Ⅰ組減少更為顯著(均P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間差異不明顯(P>0.05)，見圖5。

Figure 5. The mRNA expression of MMP-9 in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham; ## P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP Ⅰ.

討 論

目前研究表明，腦水腫是腦缺血再灌注損傷后BBB破壞所引起的主要表現(xiàn)。同時(shí)，BBB通透性增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致大量有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，引起細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變，進(jìn)一步加重腦水腫，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[8]。MMP-9因有較強(qiáng)降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，常被作為評(píng)價(jià)BBB完整性的檢測(cè)指標(biāo)[1, 9-10]。EB作為一種示蹤劑可直接反映BBB的通透情況，腦含水量是評(píng)價(jià)腦水腫的直接指標(biāo)[11]，可間接反映BBB的開放程度。電鏡下的觀察，是對(duì)血腦屏障形態(tài)學(xué)變化最有力的說明[12]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血2 h再灌注24 h后，MMP-9表達(dá)明顯上調(diào)，EB含量和腦含水量大幅增加，電鏡攝片也顯示血腦屏障緊密連接融合、擴(kuò)張，毛細(xì)血管明顯變形，內(nèi)皮細(xì)胞大量溶解，多處基膜片狀溶解、斷裂，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

丁苯酞是人工合成的消旋體，可改善腦缺血所致的腦損傷，有較強(qiáng)的抗缺血作用，能夠明顯縮小腦缺血的梗死體積，減輕腦水腫，抑制細(xì)胞凋亡，改善缺血區(qū)的微循環(huán)和腦能量代謝[14]。本實(shí)驗(yàn)不再探討丁苯酞的治療作用，而是將其預(yù)處理于腦缺血再灌注損傷的大鼠，探討其對(duì)腦缺血的預(yù)防性保護(hù)作用。結(jié)果顯示，丁苯酞20 mg/kg預(yù)處理后，腦水腫減輕，BBB通透性降低，MMP-9表達(dá)下調(diào)，提示預(yù)防性應(yīng)用丁苯酞后，小劑量即可起到保護(hù)作用。

為了探討丁苯酞預(yù)處理大鼠的合適劑量，我們又做了中、高(40、80 mg/kg)劑量的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)劑量組與低劑量組相比，腦水腫進(jìn)一步減輕，BBB通透性降低，MMP-9表達(dá)明顯減少，同時(shí)，中、高劑量組之間在上述指標(biāo)中雖有數(shù)值的差異，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，提示應(yīng)用40 mg/kg的丁苯酞預(yù)處理腦缺血再灌注損傷大鼠，可發(fā)揮較好的保護(hù)作用。

綜上所述，丁苯酞預(yù)處理可減輕腦水腫，減少BBB的通透性，發(fā)揮一定的預(yù)防性保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，降低因血腦屏障通透性增加帶來的神經(jīng)損傷。此外，本研究還采用了不同劑量的分組，找到了預(yù)處理應(yīng)用于大鼠的最佳劑量，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供有力的基礎(chǔ)支持。

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