楊 朝， 耑 冰， 張麗萍， 趙 霞， 張建銀， 葛利軍， 吳昌歸

(寧夏人民醫(yī)院 1總院呼吸內(nèi)科， 2心血管內(nèi)科，寧夏 銀川 750011； 3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710000)

缺氧時(shí)選擇性收縮肺動脈對于調(diào)節(jié)動脈氧合作用非常重要，然而，在機(jī)體整個(gè)處于缺氧狀態(tài)下，如呼吸系統(tǒng)疾病或高原缺氧等，缺氧肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)導(dǎo)致肺動脈壓力異常增高，長期反復(fù)發(fā)生可以形成或加劇肺動脈高壓(pulmonary hypertension)的發(fā)生發(fā)展[1]。目前HPV發(fā)病的分子機(jī)制，如肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs) 哪個(gè)部位感知缺氧、缺氧信息如何轉(zhuǎn)導(dǎo)最后導(dǎo)致肺動脈收縮還不十分清楚。多數(shù)研究認(rèn)為PASMCs線粒體感知缺氧并始動了HPV的發(fā)生[2-3]，線粒體產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要是過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)在傳遞缺氧信息中起著重要的作用，但線粒體在缺氧時(shí)產(chǎn)生ROS的位點(diǎn)還不很清楚。Michelakis等[4]研究認(rèn)為缺氧可以引起線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)復(fù)合物I及III位點(diǎn)產(chǎn)生ROS減少從而導(dǎo)致HPV，而更多研究認(rèn)為線粒體ETC復(fù)合物I、II、III和IV均與HPV有關(guān)[5-6]。因此，本研究通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察缺氧時(shí)PASMCs 產(chǎn)生ROS的變化，同時(shí)直接分離線粒體，用熒光分光光度法檢測其生成量及生成的具體位點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

健康成年雄性SD 大鼠體重(200±15) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，自由進(jìn)食飲水；DMEM、胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)青、鏈霉素均為Gibco產(chǎn)品；二硫蘇糖醇 和4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, HEPES] 購自Roche；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自Abcam；生物素化山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz；SABC試劑與DAB顯色劑購自Pierce；膠原酶I、分子探針chloromethyl dichlorodihydrofluorescein diacetate(CM-H2DCF/DA)和RedoxSensor Red CC-1、線粒體ETC復(fù)合物I抑制劑1-methyl-4-phenylpyridinium iodide (MPP，5 μmol/L)、復(fù)合物II抑制劑3-nitroproprionic acid (NPA，5 mmol/L) 及2-tenoyltrifluoroacetone (TTFA, 10 μmol/L)、復(fù)合物III前泛半醌位點(diǎn)抑制劑myxothiazol (10 μmol/L)、復(fù)合物III后泛半醌位點(diǎn)抑制劑antimycin A (5.7 μmol/L)和復(fù)合物IV抑制劑sodium azide (NaN3，1 mmol/L)、呼吸緩沖液[包括5 mmol/L丙酮酸(pyruvate)、2.5 mmol/L蘋果酸(malate)、10 μmol/L dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF/DA; 分子探針) 和5 μmol/L辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)] 均購自Sigma；細(xì)胞線粒體分離試劑盒購自碧云天公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 大鼠PASMCs分離、培養(yǎng)、鑒定和分組

參照我實(shí)驗(yàn)室既往方法[7]分離及培養(yǎng)PASMCs，經(jīng)平滑肌α-actin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為平滑肌細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)分8組：(1) 常氧組；(2)急性缺氧組；(3)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物I抑制劑MPP組；(4)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物II抑制劑NPA組；(5)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物II抑制劑TTFA組；(6)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物III前泛半醌位點(diǎn)抑制劑myxothiazol組；(7)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物III后泛半醌位點(diǎn)抑制劑antimycin A組；(8)急性缺氧+線粒體ETC復(fù)合物IV抑制劑NaN3組。

常氧的實(shí)驗(yàn)條件為：35 ℃，21% O2，5% CO2，74% N2；急性缺氧的實(shí)驗(yàn)條件為：35 ℃， 1% O2，5% CO2，94% N2，持續(xù)5 min[8]。

3 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測

4 線粒體的分離

參照Korde等[3]的方法分離線粒體，取生長良好的PASMCs，胰酶消化并收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞500×g、4 ℃離心5 min，棄上清。每(2～5)×107細(xì)胞中加入1～2.5 mL線粒體分離試劑(根據(jù)細(xì)胞樣品數(shù)量，在線粒體分離試劑加入到細(xì)胞樣品中前2～3 min內(nèi)加入蛋白酶抑制劑PMSF，使PMSF的終濃度為1 mmol/L)，重懸細(xì)胞，冰浴10～15 min。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中勻漿30下，然后將細(xì)胞勻漿在1 300×g、4 ℃離心3 min，取上清，沉淀用同樣方法再進(jìn)行1次，再取上清。將獲得的上清液在13 000×g、4 ℃離心10 min, 棄上清，沉淀用線粒體分離試劑(已加入PMSF)重懸，再在10 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清，得到沉淀即為線粒體，用150～200 μL 線粒體儲存液重懸線粒體待用。所有步驟均在冰上或4 ℃進(jìn)行，所用溶液均冰浴或4 ℃預(yù)冷。

5 線粒體ROS的檢測

參照Korde等[3]的方法測定線粒體ROS。取線粒體懸液加入96孔板，每孔線粒體蛋白濃度測定約為50 μg ，加入呼吸緩沖液(5 mmol/L 丙酮酸，2.5 mmol/L 蘋果酸，10 μmol/L H2DCF/DA及5 μmol/L HRP)，室溫孵育30 min，用FlexStation-III分光光度計(jì)(Molecular Devices)檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長532 nm. 在每一實(shí)驗(yàn)中，ROS的量根據(jù)測定量減去背景熒光強(qiáng)度(只加入呼吸緩沖液而無線粒體樣本時(shí)測得的熒光強(qiáng)度)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，成組資料的比較用t檢驗(yàn)，多組資料的比較采用F檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSS 13.0軟件包處理。

結(jié) 果

1 肺動脈平滑肌細(xì)胞的鑒定

生長中的PASMCs見圖1A。經(jīng)α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色，在高倍鏡下可見α-SMA在胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，呈棕色平行纖維絲狀結(jié)構(gòu)，見圖1B。

Figure 1. The growth of PASMCs (A, ×300) and the positive expression of α-smooth muscle actin in PASMCs(B,×300).

2 常氧及急性缺氧肺動脈平滑肌細(xì)胞 ROS的生成量

3 常氧及急性缺氧PASMCs 中ROS 的生成量及生成位點(diǎn)

(1) 與常氧組比較，急性缺氧PASMCs ROS(主要是H2O2)的生成量增加了3.44倍(P<0.01)。(2) 與缺氧組比較，使用線粒體ETC復(fù)合物I抑制劑MPP(5 μmol/L)、復(fù)合物II抑制劑NPA(5 mmol/L) 和TTFA(10 μmol/L)及復(fù)合物III前泛半醌位點(diǎn)抑制劑myxothiazol (10 μmol/L)，都能顯著降低缺氧時(shí)PASMCs胞內(nèi)ROS的生成量 (分別降低60%、73%、75%和61%，P<0.01)；而復(fù)合物III后泛半醌位點(diǎn)抑制劑antimycin A (5.7 μmol/L) 及復(fù)合物IV 抑制劑NaN3(1 mmol/L) 對胞內(nèi)ROS的生成量無明顯影響(升高13%和9.1%，P>0.05)，見圖3。這提示急性缺氧時(shí)PASMCs線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位點(diǎn)生成ROS增加，而III后泛半醌位點(diǎn)和IV與此無明顯關(guān)系。

Figure 2. ROS production in the rat PASMCs under the conditions of normoxia and hypoxia. A: H2O2 concentration-dependently increased DCF fluorescence intensity in the rat PASMCs 5 min after hypoxia (×300); B: H2O2 and concentration-dependently increased Red CC-1 fluorescence intensity in rat PASMCs 5 min after hypoxia (×300). Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs normoxia.

Figure 3. Treatment with the inhibitors of mitochondrial ETC complexes， MPP, NPA, TTFA and myxothiazol， all prevented hypoxia-induced increase in ROS production.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs hypoxia.

4 常氧及急性缺氧PASMCs線粒體ROS的生成量及生成位點(diǎn)

(1) 與常氧組相比，急性缺氧PASMCs 線粒體ROS(主要是H2O2)的生成量明顯增加(P<0.01)。(2) 用線粒體ETC復(fù)合物Ⅰ抑制劑MPP (5 μmol/L)、Ⅱ抑制劑NPA (5 mmol/L)和 TTFA(10 μmol/L)及III前泛半醌位點(diǎn)抑制劑myxothiazol (10 μmol/L)都能顯著降低缺氧時(shí)線粒體ROS的產(chǎn)生(P<0.01)，而III后泛半醌位點(diǎn)抑制劑antimycin A (5.7 μmol/L)和IV抑制劑NaN3(1 mmol/L)對線粒體缺氧ROS的產(chǎn)生無明顯影響(P>0.05)，見表1。提示，PASMCs線粒體可以感知缺氧，急性缺氧時(shí)線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位點(diǎn)生成ROS增加，而III后泛半醌位點(diǎn)和IV與此無明顯關(guān)系。

表1 急性缺氧線粒體ETC復(fù)合物抑制劑對PASMCs線粒體ROS生成量的影響

討 論

眾所周知，PASMCs細(xì)胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度(cytoplasmic free Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高是HPV發(fā)生、發(fā)展乃至導(dǎo)致HPV的效應(yīng)途徑。我們既往的研究也證實(shí)急性缺氧可引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ryanodine receptor-seneitive鈣庫的Ca2+釋放，二者均可使 [Ca2+]i升高，肺動脈收縮增強(qiáng)[7]，然而PASMCs哪個(gè)部位感知缺氧，缺氧信息如何傳遞引起 [Ca2+]i升高的分子機(jī)制還不十分清楚。由于線粒體是細(xì)胞內(nèi)耗氧量最活躍且對缺氧最敏感的細(xì)胞器，因此推測線粒體可能就是PASMCs感受缺氧的主要部位。而本研究也證實(shí)：線粒體可以直接感知缺氧，在急性缺氧情況下線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位點(diǎn)ROS生成增加，而新近的研究又證實(shí)ROS可以引起 [Ca2+]i增加[12]，由此推測HPV的發(fā)病機(jī)制可能是：急性缺氧觸發(fā)PASMCs線粒體ETC復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位點(diǎn)生成ROS增多，而ROS 本身也可以誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生更多的 ROS，即 ROS 誘導(dǎo)的 ROS 釋放(ROS-induced ROS release，RIRR)[13]；而生成增多的ROS(主要H2O2)可作為第二信使自由透過細(xì)胞器膜引起 [Ca2+]i的升高，從而導(dǎo)致HPV。

本研究顯示，線粒體ETC復(fù)合物能夠感知缺氧，其產(chǎn)生增多的ROS可能在耦聯(lián)缺氧信息與肺動脈的機(jī)械收縮過程中起關(guān)鍵作用。深入研究PASMCs感知缺氧，缺氧信息的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，有利于闡明HPV的發(fā)病機(jī)制，并最終為缺氧PH提供新的治療策略。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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