曹錦霞， 王 浩， 王紅衛(wèi)， 游 詠

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421000)

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚的活性成分，越來(lái)越多的研究表明，EGCG在神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)[1]、對(duì)抗氧化應(yīng)激[2]、抗炎[3]及抑制脂質(zhì)聚集[4]等多種生物學(xué)功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的功能[5]，還在細(xì)胞增殖分化、凋亡等諸多方面發(fā)揮作用[6]。研究已經(jīng)報(bào)道缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并引起細(xì)胞自噬[7]。由于mTOR通路發(fā)揮多種蛋白表達(dá)與功能的調(diào)節(jié)作用，我們?cè)O(shè)想mTOR通路可能介導(dǎo)了EGCG對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

目前，EGCG對(duì)低氧誘導(dǎo)的凋亡與自噬方面的研究并未深入展開(kāi)。EGCG是否能拮抗低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，以及mTOR通路是否參與其中尚未明了。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTOR的確介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致細(xì)胞凋亡與自噬。這些方面的研究結(jié)果對(duì)于相關(guān)藥物走向臨床應(yīng)用有重要的提示作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及培養(yǎng)

PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植于6、 24、 96孔板中進(jìn)行觀察及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于96孔板，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔，每孔加樣100 μL，待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí)，藥物處理24 h。然后每孔加入5 μL的CCK-8試劑。2～4 h后使用450 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A)。

3 細(xì)胞形態(tài)觀察

將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞均勻種植于24孔板，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)及以上復(fù)孔，每孔加樣500 μL，待細(xì)胞貼壁并密度達(dá)到75%時(shí)，藥物處理24 h。然后使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC-3的表達(dá)

細(xì)胞處理24 h后，PBS清洗細(xì)胞并用純冰甲醇固定；室溫下Ⅰ抗室溫孵育1 h；然后PBST快速洗2遍，Ⅱ抗避光室溫孵育1 h； PBST快速洗2遍后加入DAPI，室溫孵育2 min后使用熒光顯微鏡觀察，每孔取至少3個(gè)視野觀察并拍照。

5 Western blotting檢測(cè)beclin-1和mTOR的表達(dá)

細(xì)胞處理24 h后，提取細(xì)胞蛋白并定量。使用濃度為10%、8%的凝膠進(jìn)行蛋白電泳，電泳完畢使用PVDF膜制作“三明治”采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜完成后常溫5%脫脂奶粉TBST封閉液封閉1 h;用TBST稀釋Ⅰ抗后搖床上孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，Ⅱ抗常溫下?lián)u床孵育2 h;TBST洗膜3次后成像儀顯影。

6 ELISA檢測(cè)caspase-3的表達(dá)

細(xì)胞處理24 h后，提取細(xì)胞中的蛋白并定量。按說(shuō)明書(shū)配制好所有的試劑：酶標(biāo)板每孔加入100 μL的蛋白樣品，覆膜覆蓋后室溫在搖床上孵育3 h，3 h后去除板內(nèi)液體并在每孔加入300 μL的1×洗滌液，重復(fù)2次，然后每孔加入200 μL的1×活性液，在酶標(biāo)儀使用450 nm波長(zhǎng)處讀取A值。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SEM)表示，使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析中的最小顯著差異檢驗(yàn)(LSD)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡及自噬

1.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞的凋亡 不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理PC12細(xì)胞24 h后，顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)， CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，并提取蛋白檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示：50、150、250 μmol/L濃度的CoCl2處理后的PC12細(xì)胞狀態(tài)(可以從細(xì)胞形態(tài)，貼壁能力及突觸的長(zhǎng)度等來(lái)評(píng)估)明顯下降；細(xì)胞活力也隨CoCl2濃度依賴(lài)性下降，見(jiàn)圖1A (P<0.01)；凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)明顯升高,見(jiàn)圖1B(P<0.05)。

1.2CoCl2誘導(dǎo)的低氧促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生 PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的氯化鈷(CoCl2)處理24 h后，用Western blotting的方法檢測(cè)自噬蛋白Beclin-1的表達(dá)，并采用蛋白免疫熒光的手段觀察胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)情況。由圖1C可以觀察到beclin-1蛋白隨著CoCl2濃度的升高而表達(dá)增多，自噬標(biāo)志蛋白LC-3的表達(dá)亦存在相同的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4(LC-3的表達(dá)量通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)小藍(lán)色亮點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行評(píng)估)，提示CoCl2誘導(dǎo)的低氧確實(shí)促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生。

2 EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬

2.1EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察我們可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，150 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)的低氧對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有嚴(yán)重?fù)p傷，而加入不同濃度的EGCG后，細(xì)胞狀態(tài)較損傷組有明顯好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖2。單用EGCG則未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)與正常PC12細(xì)胞有明顯差異,見(jiàn)圖4。

同時(shí)我們使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力和ELISA檢測(cè)caspase-3表達(dá)水平從而對(duì)細(xì)胞的凋亡程度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示與150 μmol/L的CoCl2處理組相比，同時(shí)加入不同濃度的EGCG處理后，細(xì)胞活力有一定程度的恢復(fù)，見(jiàn)圖3A(P<0.01)。相比較于CoCl2處理組，不同濃度的EGCG處理后caspase-3的表達(dá)水平有一定程度的下降,見(jiàn)圖3B(P<0.01)。

Figure 1. CoCl2 induced hypoxia promoted apoptosis and autophagy in PC12 at 24 h. A: cell viability was determined by CCK-8; B: caspase-3 was determined by ELISA; C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting using an anti-beclin-1 antibody； D: mTOR expression was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs control group (0 μmoL/L).

2.2EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 我們對(duì)150 μmol/L的CoCl2以及不同濃度的EGCG處理PC12細(xì)胞24 h后的自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：CoCl2單獨(dú)處理細(xì)胞后的beclin-1表達(dá)水平明顯升高，而不同濃度EGCG的處理對(duì)beclin-1的表達(dá)水平有一定程度的抑制，見(jiàn)圖3C(P<0.05)。從免疫熒光我們可以觀察到與CoCl2單獨(dú)處理組相比，加入150 μmol/L的EGCG對(duì)細(xì)胞核內(nèi)LC-3的表達(dá)有一定程度的抑制，而單獨(dú)使用150 μmol/L的EGCG處理的PC12細(xì)胞LC-3的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異,見(jiàn)圖4。

3 EGCG通過(guò)調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬

3.1CoCl2誘導(dǎo)的低氧抑制mTOR通路的表達(dá) 為明確mTOR對(duì)EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用，我們用不同濃度的CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，Western blotting檢測(cè)mTOR的表達(dá)，從結(jié)果可以觀察到mTOR的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性下降，見(jiàn)圖1D(P<0.05)。

3.2EGCG拮抗CoCl2對(duì)mTOR通路的抑制作用 PC12細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過(guò)不同濃度的EGCG處理24 h后，mTOR表達(dá)水平相較于CoCl2處理組出現(xiàn)濃度依賴(lài)性上升，見(jiàn)圖3D(P<0.05)，單獨(dú)使用EGCG對(duì)mTOR的表達(dá)無(wú)明顯影響。提示mTOR通路可能參與介導(dǎo)了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性。

3.3雷帕霉素(mTOR特異性阻滯劑)逆轉(zhuǎn)了EGCG對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的凋亡與自噬的拮抗作用 上述結(jié)果提示mTOR通路可能參與了EGCG抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性的介導(dǎo)作用，為進(jìn)一步了解EGCG是否通過(guò)mTOR通路發(fā)揮作用，我們使用mTOR特異性阻滯劑：雷帕霉素(RAPA)來(lái)阻斷mTOR通路，從細(xì)胞狀態(tài)的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理后，EGCG對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的改善作用被逆轉(zhuǎn);單獨(dú)使用RAPA，細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯的改變,見(jiàn)圖2。使用RAPA后，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力，我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA處理，PC12細(xì)胞的活力較EGCG處理組明顯下降；同時(shí)，凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)水平升高,見(jiàn)圖5(P<0.05)。

加入RAPA處理后，EGCG對(duì)細(xì)胞自噬的抑制效果也同樣被逆轉(zhuǎn)。自噬蛋白beclin-1的表達(dá)水平較EGCG處理組有一定程度的升高，見(jiàn)圖5C(P<0.05)。同時(shí)，RAPA處理后的EGCG組LC-3在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平亦出現(xiàn)升高，見(jiàn)圖4。而單用RAPA則對(duì)LC-3在細(xì)胞核的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異。

Figure 2. Effect of EGCG on hypoxic apoptosis induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h (×400). 1: control group; 2: CoCl2 50 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L; 4： CoCL2 250 μmol/L； 5：CoCl2 150 μmol/L+EGCG 10 μmol/L； 6： CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 20 μmol/L；7: CoCl2 150 μmol/L+ EGCG 40 μmol/L; 8: EGCG 40 μmol/L; 9: CoCl2 150 μmol/L+EGCG 20 μmol/L+RAPA 100 nmol/L; 10: RAPA 100 nmol/L.

討 論

中國(guó)人飲茶的習(xí)慣最早始于神農(nóng)時(shí)代，時(shí)至當(dāng)今仍然被傳承與發(fā)揚(yáng)。茶葉中主要成分茶多酚的作用越來(lái)越得到研究者們的重視，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯作為茶多酚生物活性的主要成分，更是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)所在。據(jù)報(bào)道：EGCG一方面有積極的抗腫瘤作用，例如肺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]及胰腺癌[11]等，另一方面，對(duì)正常細(xì)胞的抗凋亡等保護(hù)預(yù)防作用[1]也多有研究。同時(shí)，眾所周知，神經(jīng)細(xì)胞缺氧會(huì)引起一系列的生理、病理反應(yīng)，像氧化應(yīng)激、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]等，當(dāng)超過(guò)細(xì)胞的清除能力時(shí)，會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。因此，深入闡明缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性的機(jī)制對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病防治和人類(lèi)的健康同樣具有重大的意義。

Figure 3. Effects of EGCG on hypoxic apoptosis and autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG for 24 h. A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B: caspase-3 was determined by ELISA; C, D: the expression of beclin-1 and mTOR was detected by Western blotting. Mean±SEM.n=3.* P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 μmol/L)； #P<0.05, ##P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group .

Figure 4. Effects of EGCG on hypoxic autophagy induced by CoCl2 in PC12 cells.PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h. The expression of LC-3 was determined by immunofluorescence using an anti-LC-3 antibody. 1: control group; 2: CoCl2 150 μmol/L; 3: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20μmol/L; 4: CoCl2 150 μmol/L + EGCG 20 μmol/L +RAPA 100 nmol/L; 5: EGCG 20 μmol/L; 6: RAPA 100 nmol/L.

EGCG拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及自噬 PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能與多巴胺能神經(jīng)元有一定相似性，廣泛地用于神經(jīng)細(xì)胞的研究。此外，一些研究表明，在許多細(xì)胞中CoCl2可以模擬誘導(dǎo)細(xì)胞的缺氧環(huán)境[14]，如PC12、C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[15]。為了明確缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，我們采用PC12細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型，不僅觀察了缺氧環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的狀態(tài)，還通過(guò)細(xì)胞活力的檢測(cè)和caspase-3的表達(dá)水平客觀評(píng)估了其凋亡程度，并檢測(cè)了細(xì)胞中自噬標(biāo)志性蛋白beclin-1和LC-3的表達(dá)，事實(shí)上，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧確實(shí)增加了細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)了細(xì)胞的自噬作用。其它相關(guān)研究也證實(shí)，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]的發(fā)生。這些研究結(jié)果都與我們對(duì)缺氧環(huán)境對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。

EGCG通過(guò)調(diào)控mTOR通路拮抗低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與自噬，mTOR是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，并影響細(xì)胞的增殖、凋亡，同時(shí)在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、自噬等生物學(xué)功能中發(fā)揮作用[17]。我們通過(guò)檢測(cè)mTOR在CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境以及EGCG處理后的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：CoCl2誘導(dǎo)的缺氧抑制了mTOR的表達(dá)，而EGCG則恢復(fù)了其活性，說(shuō)明mTOR介導(dǎo)了CoCl2誘導(dǎo)的缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性。

Figure 5. Effects of RAPA on EGCG-induced downregulation of apoptosis in PC12 cells. PC12 cells were treated with CoCl2 and/or EGCG and/or RAPA for 24 h.A: the cell viability was determined by CCK-8 assay; B:caspase-3 was determined by ELISA;C: the expression of beclin-1 was detected by Western blotting. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group；# P<0.05, ## P<0.01 vs CoCl2 150 μmol/L group.

阻斷mTOR通路后EGCG是否能拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性？為了得到答案，我們采用mTOR特異性阻滯劑雷帕霉素功能處理細(xì)胞后，結(jié)果提示細(xì)胞凋亡增加，凋亡蛋白caspase-3表達(dá)增多；自噬水平升高，自噬標(biāo)志蛋白beclin-1和LC-3表達(dá)均升高，說(shuō)明mTOR通路阻斷后，加重了CoCl2誘導(dǎo)的低氧所致的神經(jīng)毒性，抵消了EGCG拮抗低氧所致的細(xì)胞損傷，EGCG通過(guò)調(diào)控mTOR通路發(fā)揮抑制凋亡、降低自噬的生物學(xué)作用，從而拮抗低氧所致的神經(jīng)毒性。

值得注意的是，通過(guò)觀察阻斷mTOR通路表達(dá)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)加入RAPA阻斷mTOR通路后相比于對(duì)照組并未完全抑制PC12細(xì)胞的活力，并且自噬水平下降的程度有限，這提示我們可能還存在其它的通路使得EGCG發(fā)揮其抗凋亡，抑制自噬的生物學(xué)作用。

通過(guò)研究，我們證實(shí)了EGCG通過(guò)mTOR通路拮抗CoCl2誘導(dǎo)的低氧引起的PC12細(xì)胞的凋亡與自噬。這為缺氧的神經(jīng)毒性機(jī)制的研究提供了新的線(xiàn)索和思路，基于目前的研究，運(yùn)用EGCG治療神經(jīng)細(xì)胞缺氧所致的損傷或許是新的途徑與策略，同時(shí)，這對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究與治療也開(kāi)辟了新的視角。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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