鄭昌健， 胡 涵， 曹 紅， 李 軍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，疼痛醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325027)

糖尿病是威脅人類健康的常見疾病，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，臨床上以自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏以及異常性疼痛為特征，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族成員之一。趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白，屬于細(xì)胞因子中的最大家族，單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)屬于趨化因子CC亞家族，相關(guān)研究表明JNK/MCP-1信號(hào)通路是神經(jīng)病理性疼痛的重要發(fā)生機(jī)制。姜黃素作為姜科植物中的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化等作用[2]。JNK/MCP-1信號(hào)通路在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的機(jī)制尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察姜黃素對(duì)2型DNP痛閾的影響以及其減輕痛覺過敏的機(jī)制是否與JNK/MCP-1信號(hào)通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料

姜黃素、玉米油和鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購于Sigma；p-JNK多克隆抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗MCP-1(H-190)購于Novus；2390型Electronic von Fery 觸覺測痛儀及II Tc336型甩尾足底測試儀購自IITC；兔二步法試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。

2 動(dòng)物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組

雄性SD大鼠，體重160～180 g，清潔級(jí)，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)環(huán)境3 d后給予高脂高糖飼料(67%普通飼料+10%豬油+20%蔗糖+2%膽固醇+1%膽酸鈉)。保持室溫在20～25 ℃，濕度在40%～60%，于第0周、第8周分別測體重、血糖，并取尾靜脈血測血清胰島素和胰島素敏感性。飼養(yǎng)8周后大鼠禁食12 h，再給予35 mg/kg 1% STZ溶液單次腹腔注射。3 d后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn)定且≥16.7 mmol/L者入選，若血糖未達(dá)標(biāo)，則再次追加STZ，3 d后測定大鼠尾靜脈血糖。14 d后測大鼠痛閾，降低到基礎(chǔ)值的85%以下者為2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠模型組，否則剔除。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠隨機(jī)分為(n=27)：2型糖尿病神經(jīng)病理性痛組(DNP組)，不做任何處理；2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+姜黃素100 mg·kg-1·d-1組(Cur組)；2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+溶劑玉米油4 mg·kg-1·d-1組(DSC組)；2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+JNK抑制劑(10 μL/d、0.5 g/L)組(DJ組)；2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+抑制劑溶劑(10% DMSO 10 μL/d)對(duì)照組(DJS組)；2型糖尿病神經(jīng)病理性痛+姜黃素(100 mg·kg-1·d-1)+MCP-1激動(dòng)劑(10 μL/d、1 mg/L)組(DM組)。另取27只喂以普通飼料的大鼠作為正常對(duì)照組(C組)。各組連續(xù)給藥14 d。

3 方法

3.1胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)測定 在第8周時(shí)對(duì)照組和模型組大鼠，禁飲禁食12 h后測定其血糖值，同時(shí)通過尾靜脈取血，利用胰島素ELISA試劑盒測定其血清胰島素水平。按照公式 1/空腹血糖×空腹計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)，此計(jì)算出的數(shù)值為非正態(tài)分布，故采用其自然對(duì)數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

3.2痛閾測定 在STZ注射前測定大鼠的機(jī)械縮足痛閾(mechanical withdrawal threshold, MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)作為痛閾的基礎(chǔ)值，在STZ注射2周后和各給藥組的第3、7、14天測定機(jī)械縮足痛閾和熱縮足潛伏期。

3.3機(jī)械縮足痛閾的測定 將大鼠置于底為金屬篩網(wǎng)(1 cm×1 cm)的透明有機(jī)玻璃箱(22 cm×22 cm×22 cm)中，玻璃箱被架高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面 50 cm。待大鼠在箱中適應(yīng)15 min后，用IITC-2390 型Electronic von Fery觸覺測痛儀垂直刺激大鼠雙后趾，單次刺激時(shí)間≤ 1 s，刺激間隔10 s。記錄測試時(shí)大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為時(shí)的刺激強(qiáng)度值，測5次取平均值即為其MWT。

3.4熱縮足潛伏期測定 用IITC336甩尾足底測試儀于上述各時(shí)點(diǎn)測定TWL。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，使用熱輻射照射其后趾相應(yīng)部位，記錄從照射到縮爪回避的時(shí)間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5 min，取后3次的平均值即為其TWL。

3.5標(biāo)本取材和處理 分別于注藥后3 d、7 d、14 d隨機(jī)選取3只各組的大鼠取其腰膨大和L4～6背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gan-glion；DRG)，并放入超低溫冰箱中備用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。另取3只各組大鼠麻醉后經(jīng)心臟插管灌注4%多聚甲醛，取L4～6節(jié)段脊髓及DRG，固定后石蠟包埋，切片。

3.6Western blotting 利用BCA蛋白測試盒測出總蛋白。按照35 μg、15 μL每孔上樣，10%聚丙烯凝膠電泳濃縮膠40 V，分離膠100 V分離，切膠后將相應(yīng)分子量條帶上的目的蛋白和內(nèi)參照蛋白在300 mA條件下轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入JNK抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)中，4 ℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST洗膜3次，每次5 min，Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后用TBST洗膜(同前)、ECL曝光，采用AlphaEasefcTMSoftware進(jìn)行分析，以目的蛋白/GAPDH的灰度比值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

3.7ELISA測定目的蛋白 組織勻?qū)⒂肂CA試劑盒測定總蛋白，按照每孔200 mg的量與ddH2O配成100 μL總體積，稀釋10倍后按照ELISA 說明書上的操作順序進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際濃度，以ng/L表示。所有A值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品A值計(jì)算相應(yīng)MCP-1含量，再乘以稀釋倍數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以最小顯著差異法(LSD)行兩兩比較。用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血糖、胰島素敏感指數(shù)變化情況

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的血糖在第8周后升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；空腹血糖濃度明顯升高(P<0.05)，但沒達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；空腹胰島素濃度明顯升高(P<0.05)。胰島素敏感性指數(shù)明顯下降(P<0.05),見表1。

表1 對(duì)照組和模型組血糖、胰島素和ISI的比較

2 各組MWT和TWL的變化

與基礎(chǔ)值相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組在STZ注藥的2周后MWT和TWL出現(xiàn)明顯降低；與DNP組相比，Cur組和DJ組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d后MWT和TWL開始升高(P<0.05)。DM組在給予MCP-1激動(dòng)劑后MWT和TWL明顯下降(P<0.05)，但與Cur組對(duì)比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DSC組、DJS組與DNP組相比差異無顯著,見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)TWL和MWT的變化

3 Western blotting檢測脊髓背角和DRG中p-JNK的表達(dá)

與對(duì)照組相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組p-JNK表達(dá)升高(P<0.05)；與DNP組相比，Cur組、DJ組、DM組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d、14 d時(shí)表達(dá)下降(P<0.05)。DSC組、DJS組與DNP組相比差異不顯著,見圖1、2。

Figure 1. p-JNK expression in DRG detected by Western blotting.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

Figure 2. p-JNK expression in dorsal cord detected by Western blotting.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

4 ELISA法測定大鼠脊髓背角和DRG中MCP-1表達(dá)

與對(duì)照組相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組MCP-1表達(dá)升高(P<0.05)；與DNP組相比，Cur組、DJ組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d、14 d時(shí)表達(dá)下降(P<0.05),DM組表達(dá)顯著增高(P<0.05)。DSC組、DJS組與DNP組相比差異無顯著,見圖3、4。

Figure 3. MCP-1 expression in DRG detected by ELISA.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

Figure 4. MCP-1 expression in dorsal cord detected by ELISA.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

討 論

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為異常性疼痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏[3-4]。高糖、糖基化終末產(chǎn)物增加等因素所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和線粒體功能損害，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞和施旺細(xì)胞的凋亡[5-7]，在DNP中起著重要作用。近年來對(duì)1型糖尿病所致的神經(jīng)病變的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但2型糖尿病所致的神經(jīng)病變的機(jī)制尚未明確。

JNK是MAPK家族成員。又稱為“應(yīng)激激活蛋白激酶”， 趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白，屬于細(xì)胞因子中的最大家族。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族。MCP-1主要通過受體CCR2實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)，趨化因子受體可以激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如MAPK途徑、蛋白激酶C途徑、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K))途徑[8]，從而導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)。

神經(jīng)損傷主要通過初級(jí)感覺神經(jīng)元產(chǎn)生自發(fā)電位(異位沖動(dòng))和脊髓背角突觸傳遞效率的持續(xù)性增強(qiáng)(LTP)導(dǎo)致病理性疼痛，研究表明TNF-α在神經(jīng)病理性疼痛中起著重要作用，神經(jīng)損傷可以激活JNK使轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化從而促使細(xì)胞釋放MCP-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)，通過作用于脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)上的趨化因子受體(CCR2)、腫瘤壞死因子受體(TNFR1、TNFR2)，導(dǎo)致初級(jí)神經(jīng)元上Na1.3和Na1.8過度表達(dá)引起異位沖動(dòng)[9-11]。同時(shí)TNF-α還可以通過激活JNK從而激活瞬時(shí)受體電位香草酸亞型及興奮性受體NAMD通道，引起胞內(nèi)Ca2+升高，導(dǎo)致鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)自身磷酸化，從而使其發(fā)生自身激活，激活后的CaMKⅡ磷酸化突觸后靶蛋白α-氨基羥甲惡唑丙酸、突觸素Ⅰ、微管相關(guān)蛋白，使脊髓背角神經(jīng)元敏感化和痛覺增強(qiáng)，參與LTP產(chǎn)生和維持[12],導(dǎo)致痛覺過敏。

這些都說明JNK/MCP-1信號(hào)通路在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。我們的研究顯示正常情況下大鼠的脊髓和DRG中的p-JNK和MCP-1表達(dá)很少，但在STZ誘導(dǎo)后p-JNK、MCP-1表達(dá)明顯升高，JNK抑制劑可以明顯下調(diào)MCP-1的表達(dá)，但MCP-1激動(dòng)劑不能使JNK表達(dá)升高，提示JNK/MCP-1的激活在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素。姜黃素具有多方面藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤及抗微生物等作用。近年來研究表明，姜黃素具有強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激作用。相關(guān)研究表明，姜黃素可以抑制AP-1、NF-κB等核內(nèi)因子的轉(zhuǎn)位從而減少M(fèi)CP-1的釋放，從而起到緩解DNP的作用，同時(shí)姜黃素可以通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥物質(zhì)的釋放[2，13]，來達(dá)到治療DNP的目的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯減輕2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠痛覺過敏，且可使p-JNK和MCP-1表達(dá)相比糖尿病組發(fā)生明顯下降，同時(shí)JNK抑制劑組中MCP-1出現(xiàn)下降，MCP-1激動(dòng)劑組并沒有出現(xiàn)JNK的增高，這些說明MCP-1可能是JNK的一個(gè)下游因子，故推測姜黃素治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與JNK/MCP-1信號(hào)通路有關(guān)系。抑制該通路可能成為治療2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的一個(gè)新的研究方向。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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