汪軍兵， 林麗清， 江明亮， 陸大祥， 陳桂玲， 行妍妍， 董 軍 △

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400； 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2病理生理學(xué)教研室， 3國家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)三級科研實驗室，廣東 廣州 510632 )

自噬(autophagy)是細胞內(nèi)某些胞質(zhì)成分通過一系列嚴格調(diào)控的途徑，最后被溶酶體內(nèi)蛋白酶降解，釋放出大分子物質(zhì)再循環(huán)的過程。巨自噬[1](macroautophagy)是指胞質(zhì)成分被囊泡樣雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹后，再與溶酶體融合成自噬溶酶體進行降解，此種類型在自噬的3種方式中最為多見，本文提及的自噬均指巨自噬。有關(guān)自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路較為復(fù)雜，其中研究得最多的是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)依賴性信號通路。

HIV-1 gp120是人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1, HIV-1)表達于病毒表面的包膜糖蛋白，HIV-1 gp120V3環(huán)是其5個可變區(qū)之一，是HIV-1病毒輔助受體的特異性和細胞嗜性的主要決定因子，參與組成輔助受體結(jié)合位點，而且V3環(huán)還參與gp120與輔助受體結(jié)合過程并在其中起主要作用[2]。艾滋病感染者中40%～60%會發(fā)展為HIV相關(guān)神經(jīng)認知障礙(HIV-associated neurocognitive disorder, HAND)，其機制至今尚未完全闡明。HIV-1 gp120是神經(jīng)元損傷的一個重要因素，以HIV-1 gp120作用于神經(jīng)元是研究HAND損傷機制的一個常用細胞模型。

在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中至少存在6類電壓門控鈣離子通道，L型Ca2+通道是其中之一，它是導(dǎo)致細胞鈣離子內(nèi)流的主要因素[3]。本室前期研究已經(jīng)證實[4]，HIV-1 gp120V3環(huán)可引起原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡，且參與L型Ca2+通道電流的改變；然而，關(guān)于mTOR依賴性自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響尚未見報道。

本實驗以HIV-1 gp120作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，同時加入mTOR依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑及激動劑，以全細胞膜片鉗記錄L型Ca2+通道電流，旨在研究自噬中mTOR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響，從而為臨床上HAND的防治提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

gp120V3環(huán)購自Raybiotech；3-MA購自Sigma；rapamycin購自StressMarq；Neurobasal 培養(yǎng)基及B27購自Gibco；多聚賴氨酸購自Sigma。電極外液組成： NaCl 120，CsCl 5，TEA-Cl 10，BaCl210，HEPES 10，MgCl21，TTX 0.0005。電極內(nèi)液組成：CsCl 120，MgCl22，Na2ATP 5，HEPES 10，glucose 11，EGTA 11。

2 細胞培養(yǎng)和實驗分組

取新生24 h內(nèi)SD乳鼠，用裝有75%乙醇的噴壺噴滿乳鼠全身，無菌環(huán)境下開顱分離雙側(cè)海馬，置預(yù)冷PBS 液中洗滌3遍去除血液，然后轉(zhuǎn)入20 mL小玻璃瓶中，眼科剪剪碎，再轉(zhuǎn)入無菌100 mL輸液瓶中，加入相當(dāng)于海馬組織總體20倍左右的DMEM/F12液與0.25%胰蛋白酶混合液(1∶1)，置37 ℃培養(yǎng)箱消化15 min，中間吹打2次，每次20 s，再加入胎牛血清1 mL終止消化，分別用200目和400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾去除組織塊，吸取濾過液， 4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液重懸細胞，收集懸液，取5 μL懸液以1∶1體積加入臺盼藍染色，觀察細胞存活狀態(tài)，調(diào)整細胞濃度5×108/L，種植于經(jīng)10 % 多聚賴氨酸包被的petri皿內(nèi)，4 h全量換液，更換為含2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(Neurobasal培養(yǎng)基-2%B27條件培養(yǎng)基可抑制膠質(zhì)細胞分裂生長，促進海馬神經(jīng)元生長成熟)，之后每3 d半量換液1次，取培養(yǎng)7 d 的海馬神經(jīng)元用于實驗。

實驗分為2個平行實驗組，即空白對照組、gp 120V3組、自噬阻斷劑3-MA組和gp120V3+3-MA組；空白對照組、gp120V3組、自噬激動劑rapamycin組和gp120V3+rapamycin組。

3 全細胞記錄

玻璃毛坯經(jīng)P97微電極拉制儀經(jīng)三步法拉制成尖端直徑為2～3 μm的電極，沖灌電極內(nèi)液。去培養(yǎng)液，以電極外液輕洗去雜質(zhì)，換上電極外液，將皿置于倒置顯微鏡載物臺上，20倍物鏡找到胞體光亮飽滿的神經(jīng)元，沖灌玻璃微電極并將其安裝在放大器探頭的電極夾持器上，在電壓鉗模式下用微操縱器引導(dǎo)玻璃微電極靠近細胞，在電極入液后始終給予5 ～6 cm H2O的正壓，以防尖端堵塞。將微電極尖端調(diào)整至胞體正上方，然后在持續(xù)正壓的同時讓電極尖端緩慢靠近細胞，利用特定的測試方波判斷細胞的封接狀態(tài)。待電極尖端接觸細胞表面時，顯示的方波會因封接阻抗增大而產(chǎn)生相應(yīng)變化，輕輕給予電極內(nèi)負壓，形成高阻封接(1 GΩ)，此時形成貼附式膜片(cell-attached patch)，正確補償電容后穩(wěn)定1 min，再給予負壓吸破電極尖端的細胞膜，此處細胞內(nèi)、外液相通，補償電容電流和串聯(lián)電阻，形成全細胞膜片鉗(whole-cell patch)，穩(wěn)定3～5 min進行記錄。實驗中的串聯(lián)阻抗在進行補償時可由放大器面板直按讀出，并被補償65%～75%。電流信號經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，數(shù)據(jù)經(jīng)Digtal 1320A轉(zhuǎn)換器記錄，采樣頻率為5 kHz，濾波頻率為1 kHz。記錄時，將高阻封接的細胞電位鉗制在-50 mV持續(xù)300 ms，階躍10 mV的10個去極化電壓鉗制記錄L-型Ca2+通道電流-電壓曲線。實驗中鉗制電壓和電路電阻隨時被檢測，只有基線、鉗制電壓和電路電阻穩(wěn)定的數(shù)據(jù)才被納入分析數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用Clamfit 10.2軟件和SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，所得電流利用膜電容標(biāo)化后以電流密度(pA/pF)表示，繪制I-V曲線。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機設(shè)計單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 自噬抑制劑3-MA對gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元L-型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型Ca2+通道電流在空白對照組、gp120V3(1 mg/L)組、3-MA(5 mmol/L)組和gp120V3+3-MA組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)平均值分別為-9.63±1.43、-16.06±1.57、-19.15±2.21和-22.55±2.08；gp120V3組及3-MA組與空白對照組比較，有顯著差異(P<0.05),說明加入gp120V3環(huán)或加入3-MA均可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強；gp120V3+3-MA組與gp120V3組比較，有顯著差異(P<0.05)，提示加入3-MA抑制自噬后可使受gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強，見圖1。

2 自噬激動劑rapamycin對gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型鈣離子通道電流在空白對照組、gp120V3(1 mg/L組)、rapamycin(2 μmol/L)組和gp120V3+rapamycin組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)為9.63±1.43 、-16.06±1.57、-5.68±0.48和-7.46±0.83，gp120V3組及rapamycin組與空白對照組比較，有顯著差異(P<0.05),說明加入gp120V3環(huán)可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強，加入rapamycin可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流減弱；gp120V3+rapamycin組與gp120V3組比較，差異顯著(P<0.05)，提示加入自噬激動劑rapamycin后可使受gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流減弱，見圖2。

Figure 2. The effect of autophagic excitor rapamycin on the peak current amplitude of hippocampal neurons treated with gp120V3 loop. A： voltage steps of L-type calcium channel; B： the average peak current amplitude in different groups; C： I-V curves of peak current density in different groups; D： bar chat of peak current density in different groups. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs gp120V3 group.

討 論

自噬具有雙重功能，當(dāng)自噬在對不同形式的細胞應(yīng)激作出反應(yīng)時可被快速上調(diào)，這種快速的自噬誘導(dǎo)可以通過清除細胞內(nèi)受損的細胞器、毒性代謝分子及細胞內(nèi)的病原體，并通過產(chǎn)生維持細胞重要功能所必需的細胞內(nèi)構(gòu)件，以利于細胞的生存，但自噬的持續(xù)性激活也可導(dǎo)致細胞最終發(fā)生自噬性細胞死亡[5]。

在自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，mTOR信號通路是研究得最多的一條，它包括AMPK/mTOR和ERK/ mTOR和PI3K-Ⅰ/ mTOR，但這3類均要通過信號分子mTOR。AMPK可抑制mTOR，對自噬起增強作用，ERK和Ⅰ型PI3K激動mTOR，對自噬起抑制作用[6]。Rapamycin是自噬激動劑，它可與靶點mTOR結(jié)合抑制其活性，從而增強自噬。3-MA是Ⅲ型PI3K的抑制劑。Ⅲ 型PI3K位于mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游，它與beclin 1形成復(fù)合物參與自噬體的形成，對自噬起到促進作用，故3-MA可抑制自噬，是科研實驗中廣泛使用的一種自噬阻斷劑[7]。

HIV-1 gp120是HIV-1的一種包膜糖蛋白，可致神經(jīng)元凋亡[8]，但對神經(jīng)元自噬的影響報道較少。Zhou等[9]以gp120作用于神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞6 h，發(fā)現(xiàn)細胞自噬增強。

HIV-1 gp120既可引起海馬神經(jīng)元自噬增強，亦可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，這其中自噬與凋亡的關(guān)系還未研究清楚。Qin等[10]將自噬和凋亡的標(biāo)記物共同標(biāo)記在同一神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞上，發(fā)現(xiàn)自噬與凋亡同時存在，但損傷后不同時間內(nèi)自噬與凋亡陽性細胞數(shù)不同，傷后短時間以自噬為主，隨時間延長則以凋亡為主。

在本實驗中，加入gp120V3環(huán)后乳鼠海馬神經(jīng)元細胞膜上的L型Ca2+通道電流增強。結(jié)果顯示與正常對照組相比，3-MA使L型Ca2+通道電流增強，而rapamycin使L型Ca2+通道電流減弱，說明在正常生理情況下，通過對mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行抑制或激動可使海馬神經(jīng)元L型Ca2+通道電流發(fā)生改變。同時結(jié)果還顯示 gp120V3+3-MA組較gp120V3組L型Ca2+通道電流增強，gp120V3+rapamycin組較gp120V3組L型Ca2+通道電流減弱，說明海馬神經(jīng)元在HIV-1 gp120V3環(huán)作用的環(huán)境下，通過對mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行抑制或激動亦使L型Ca2+通道電流發(fā)生改變。

本實驗從電生理角度證明，自噬可能參與了HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的改變。為臨床上對自噬進行干預(yù)，即通過改變自噬狀態(tài)來保護海馬神經(jīng)元，從而防治HAND提供理論依據(jù)。

[參 考 文 獻]

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