王海華， 姜玉新, 王 靜, 周萍萍， 包鵬舉， 曾 瑾， 王海珍

(皖南醫(yī)學院生理教研室，安徽 蕪湖 241002)

冠心病、心肌缺血和心肌梗死是臨床上的常見病多發(fā)病[1]，出現(xiàn)典型的心絞痛癥狀，是由于多種化學和物理因素改變了心臟微環(huán)境所產生的一系列復雜的病理生理過程[2-6]。誘發(fā)心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)傳至中樞神經系統(tǒng)，進而引起或整合多種心血管反射[3-4, 7]。通過向心包腔注入炎性滲出液和/或暫時結扎冠狀動脈前降支是復制心絞痛動物模型的常用方法[8]，由于多種化學和物理因素改變了缺血期間心臟微環(huán)境，使心肌細胞外液一些物質的濃度升高，包括緩激肽、P物質、前列腺素、白三烯、乳酸、鉀和腺苷[6]，而這些物質激活了心臟的感覺傳入神經元[3, 6, 8-15]，其中包括脊髓T1～6和/或C1～3神經元的激活[2, 13, 16-17]。

通常情況下，典型的心肌缺血心絞痛患者常出現(xiàn)左前胸壁疼痛，并放射到左臂、頸部和下顎[18]，心肌缺血激活心臟的感覺傳入神經元興奮投射至上頸髓和/或胸髓以及脊髓丘腦束神經元[19-21]。然而，最新研究表明，有相當一部分心肌缺血患者，在心肌缺血期間無上述典型癥狀，而顱面部疼痛是其唯一的癥狀[22]，常導致誤診而延誤治療[23-26]。雖然心源性顱面部疼痛內在的神經機制尚不明晰，但依然可作為臨床上的輔助診斷措施[27]，研究報道迷走神經在介導顱面部疼痛中可能發(fā)揮一定作用[3, 28-29]。

顱面部組織受三叉神經分支的專一支配，顱面部感覺傳入信息(包括傷害性傳入信息)經過初級傳入纖維到達三叉神經脊束核，再傳入中樞腦干[30-31]。在此期間，有害的信息經初級傳入纖維激活位于三叉腦干感覺核復合體二級神經元，其中包括三叉神經脊束核尾部、極間部和口部神經元，它們在顱面部有害的信息傳輸過程中起著重要作用[31]。許多研究表明，用有害的電和化學刺激心臟左側迷走神經分支，可以激活位于三叉神經丘腦束水平的左側脊髓丘腦束神經元[2, 32]。我們由此提出假設，心源性顱面部疼痛可能涉及到脊髓頸段及三叉腦干感覺核復合體神經元的激活，三叉神經脊束核神經元的活化尤為關鍵。

c-Fos是即刻早基因中的一種，正常情況下，c-Fos在多數(shù)神經元中有低水平表達，細胞內c-Fos蛋白很少，不易檢測到，但在接受刺激后表達水平可以迅速而短暫提高, 根據(jù)c-Fos可以被刺激誘導快速短暫表達的特性, 其產物c-Fos蛋白可作為中樞神經元興奮活化的標志[33]，鑒于此，本實驗通過從大鼠心包腔注入炎性滲出液復制心肌缺血心絞痛大鼠模型，運用免疫組化方法，以神經元活化為線索，觀察大鼠脊髓和腦干神經元c-Fos表達，特別關注大鼠腦干三叉神經感覺核復合體神經元c-Fos的表達，進而為臨床上部分心肌缺血患者顱面部疼痛是其唯一癥狀提供了實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

Wistar雄性大鼠(300～350 g)購于美國德克薩斯州，動物分籠喂養(yǎng)，以鋸末為墊料，每籠3～4只，大鼠自由攝食和飲水，實驗室配置，12/12 h(8:00～20:00)的光-暗循環(huán)周期，溫度和濕度分別保持在(23±0.5)℃和60%。實驗程序符合昭和大學動物研究倫理委員會標準，并遵照國際疼痛研究協(xié)會的指導守則進行[34]。

2 動物模型制備

2.1動物手術準備 大鼠用氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg， ip)麻醉后，仰臥固定于鼠臺上，通過氣管插管，連接動物呼吸機維持正常通氣(呼氣末CO2濃度維持在3.5%～4.5%之間)，同時分離右側頸靜脈，行頸靜脈插管，在實驗過程中，從頸靜脈不定時地補充注入氨基甲酸乙酯(30 mg/kg， ip)對大鼠進行維持麻醉，體溫保持在37 ℃。行大鼠左股動脈插管，由壓力換能器經Spike2(CED)記錄大鼠動脈血壓(blood pressure，BP)，同時記錄心電圖以觀察大鼠心率(heare rate，HR)的變化。

2.2心包腔內注射炎性滲出液(inflammatory exudate solution, IES) 在文獻[6]報道方法的基礎上稍做修改，簡言之，血壓測量和氣管插管手術后，實施心包內注射炎性滲出液(IES組，n=4)大鼠，通過胸骨中線左側肋骨第2～3肋間隙開胸，露出胸腺，在靠近心底部分離胸腺一定長度找到一開口，經該處插入一小段硅膠管進入心包腔，由1 mL注射器向硅膠管內注入0.2～0.5 mL 37 ℃生理鹽水，在注藥的間期緩慢注入0.2 mL生理鹽水沖洗心包腔。在輸注IES期間，通過導管注入0.2 mL的IES，時間超過20～30 s，使其與心臟的表面接觸約2 min，然后將其緩緩地抽出(20～30 s)，然后改換成0.2 mL 37 ℃生理鹽水注入到心包腔，使其與心臟的表面接觸約2 min，然后將其緩緩地抽出(20～30 s)；每12 min時間內重復上面操作3次，然后休息10 min后；在超過1 h期間，重復上面的操作步驟3次。IES包括腺苷(10-3mol/L)，緩激肽(10-5mol/L)、前列腺素E2(10-5mol/L)、5-羥色胺(10-5mol/L)和血清素(10-5mol/L)。生理鹽水組大鼠(saline組，n=4)，在超過1 h期間，向大鼠心包腔注入生理鹽水而不是IES，操作程序同IES組。假手術組(sham組，n=4)中的大鼠外科手術同上，但不進行心包注射程序。在完成上面的程序后，讓大鼠休息90 min，然后通過導管向心包腔內注入少量(0.2 mL)伊韋氏藍染料，以驗證該導管是插到心包腔而沒有出現(xiàn)IES的漏出。

為了進一步闡明IES激活的信號通路，我們還增加了2只大鼠，事先給予納洛酮(一種阿片受體拮抗劑，1 mg/kg， ip)和育亨賓(一種α2腎上腺素受體拮抗劑，3 mg/kg， ip)20 min，然后再進行大鼠心包腔注入IES程序。

3 免疫組化實驗

在實驗程序結束，給予大鼠大劑量的氨基甲酸乙酯(600 g/L)，然后用4 ℃ 的PBS 500 mL從大鼠心尖部對心臟灌流，從右心耳流出，接著用4 ℃ 的4%多聚甲醛對心臟灌流，然后將大鼠埋入冰塊中1 h，后手術取出大鼠頸段脊髓和腦干，放置于4 ℃含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液中(pH 7.4)冷凍固定3～7 d，后改放入在4 ℃含30%蔗糖的磷酸緩沖液中3～7 d。在-20 ℃的超速冷凍切片機中將其連續(xù)橫向切割成50 μm的薄片，并立即轉移到含有4 ℃ PBS的聚丙烯盒保存。第2天，對上面薄片用4 ℃PBS沖洗10min ，重復3次，然后將切片放入含3%的H2O2PBS液中孵育30 min以消除內源性過氧化物酶，再將薄片用4 ℃ PBS沖洗10 min ，重復3次，然后在含有3%山羊血清(Vector Laboratories)的封閉溶液中孵育30 min，再將薄片與抗兔c-Fos抗體(1∶5 000，Santa Cruz)放置在4 ℃環(huán)境下孵育過夜。在完成此次孵育后，將切片在4 ℃ PBS沖洗10 min，重復3次，并在室溫下用生物素化羊抗兔IgG(1∶1000，Dako)孵育120 min，接著再與過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(1∶1000，Dako)中孵育60 min。所有的抗體均用含有1%山羊血清和0.5%的Triton X-100的PBS稀釋。使用3’，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB，Sigma)進行過氧化物酶反應，并用硫酸鎳銨增強。將切片固定在載玻片上，風干過夜，在蓋上蓋玻片之前用中性紅復染，通過倒置顯微鏡對每只大鼠110張連續(xù)切片(從對耳線到前囟即9.16～14.66 mm)中c-Fos蛋白標記細胞進行觀察，包括三叉腦干感覺核復合體(VBSNC)，觀察的同時使用相機拍照制圖。

VBSNC分為三叉神經感覺主核腹外側部分(Pr5VL)以及三叉神經脊束核口部(Sp5O)、極間部(Sp5I)和尾部(Sp5C)。它們的命名和核區(qū)域的定義基于Paxinos and Watson(1986)的圖譜。通過對3張切片中進行計數(shù)取均值確定每只大鼠各神經核團中c-Fos陽性神經元的數(shù)目。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用Student配對t檢驗作為組內治療前后進行比較的方法。多組均數(shù)比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 實驗期間大鼠心功能變化情況

實驗期間大鼠心功能組間變化情況見表1。在整個實驗過程中，sham組大鼠平均動脈壓(mean arterial blood pressure，MAP)及HR無明顯變化(P>0.05)；saline 組，在向大鼠心包反復注入或抽出saline過程中，與靜息水平相比，大鼠MAP及HR也無明顯變化；IES組，在向大鼠心包反復注入或抽出IES過程中，與靜息水平相比，HR無顯著改變， MAP有明顯下降(P<0.05)，但在恢復過程中又回升到靜息水平，說明向心包腔反復注入或抽出saline或IES大鼠心功能沒有顯著影響。

表1 心包腔內注入IES期間心血管功能變化

2 脊髓C2節(jié)段c-Fos表達

如圖1所示，在sham 組，C2脊髓節(jié)段被檢測到幾個c-Fos陽性神經元出現(xiàn)，c-Fos陽性神經元在C2脊髓節(jié)段左、右側分布無明顯差異(P>0.05)。而saline 組大鼠C2脊髓節(jié)段c-Fos陽性神經元數(shù)量比靜息水平有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而，同sham 組和saline 組大鼠相比，IES組大鼠C2段脊髓背角I-V層c-Fos陽性神經元數(shù)量顯著增加(P<0.05)。有趣的是，IES組大鼠C2段脊髓背角I-V層c-Fos陽性神經元數(shù)量的增加，左側比右側明顯(P<0.05)，說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)傳至中樞C2段脊髓，因為心臟位于大鼠胸腔偏左側，故C2段脊髓c-Fos陽性神經元數(shù)量左側比右側明顯增多。

Figure 1. c-Fos immunoreactivity in the rat C2 spinal cord.c-Fos-positive cells are indicated with red arrows. Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs sham or saline；#P<0.05 vs right.

3 三叉神經脊束核 c-Fos陽性神經元的變化

3.1c-Fos陽性神經元在三叉神經脊束核Sp5C的變化 Saline 組大鼠三叉神經脊束核尾部(Sp5C) c-Fos陽性神經元的數(shù)量與靜息狀態(tài)相似(圖 2A)，靜息時c-Fos陽性神經元數(shù)量在Sp5C左、右側也無明顯差異(圖2B)。然而，同sham 組和saline 組大鼠相比，IES組大鼠c-Fos陽性神經元數(shù)量在Sp5C明顯大量增多(P<0.05)(圖2B)，Sp5C左側c-Fos陽性細胞數(shù)量明顯多于右側(P<0.05)(圖2B)，無論在左側還是在右側， c-Fos陽性細胞數(shù)量在膠質細胞層(GCL)明顯多于大細胞層(LCL)(P<0.05)(圖2C)，說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)由中樞C2段脊髓傳至三叉神經脊束核尾部(Sp5C)，因為心臟位于大鼠胸腔偏左側，故c-Fos陽性神經元數(shù)量左側比右側明顯增多，介導該信號的主要是三叉神經脊束核尾部的膠質細胞。用育亨賓(1 mg/kg, ip)和納絡酮(3 mg/kg, ip)預處理20 min，IES組大鼠Sp5C腹側邊c-Fos陽性神經元的表達未受影響(P>0.05)(圖2D)，說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的中樞信號上傳沒有α2-腎上腺素受體和阿片受體的參與。

3.2c-Fos陽性神經元在三叉神經脊束核Sp5I、Sp5O 和Pr5VL的變化 Sham組和saline 組大鼠c-Fos陽性神經元在三叉神經脊束核Sp5I、Sp5O 和Pr5VL均有少量c-Fos陽性神經元表達，左、右側也無明顯差異(P>0.05)。然而，同sham 組和saline 組大鼠相比，IES組大鼠呈圓錐體狀的三叉神經感覺核復合體自前囟到對耳線Pr5VL、Sp5O 和Sp5I c-Fos陽性神經元的數(shù)量逐漸增加，c-Fos陽性神經元的數(shù)量左側明顯多于右側(P<0.05), 由此說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)由中樞C2段脊髓傳至三叉神經脊束核尾部(Sp5C)，再傳至三叉神經感覺核復合體，自對耳線到前囟Sp5I、Sp5O 和Pr5VL c-Fos陽性神經元的數(shù)量逐漸減少，因為心臟位置偏左，故c-Fos陽性神經元數(shù)量左側多于右側，見圖3。

Figure 2. c-Fos immunoreactivity in rat spinal trigeminal tract neurons of the Sp5C. A: photomicrographs showing c-Fos immunoreactivity at the Sp5C level.c-Fos-positive cells are indicated with red arrows. B～D: quantification of c-Fos-positive sites in the Sp5C segment (B), in the large cell layer (LCL) and glial cell layer (GCL) of the Sp5C segment in the IES group (C), and in the Sp5C segment in the IES group pretreated with yohimbine (Yoh) and naloxane (Nal) prior to IES (D).Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs sham or saline;#P<0.05 vs right；△P<0.05 vs LCL.

討 論

通常情況下，典型的心肌缺血心絞痛患者常出現(xiàn)左前胸壁疼痛，并放射到左臂、頸部和下顎[18]。然而，最新研究表明，有相當一部分心肌缺血患者，在心肌缺血期間無上述典型癥狀，而顱面部疼痛是其唯一的癥狀[22]。

顱面部組織受三叉神經分支的專一支配，顱面部感覺傳入信息(包括傷害性傳入信息)經過初級傳入纖維到達三叉神經脊束核，再傳入中樞腦干[30-31]。在此期間，有害的信息經初級傳入纖維激活位于三叉腦干感覺核復合體二級神經元，其中包括三叉神經脊束核尾部、極間部和口部神經元，它們在顱面部有害的信息傳輸過程中起著重要作用[31]。許多研究表明，用有害的電和化學刺激心臟左側迷走神經分支，可以激活位于三叉神經丘腦束水平的左側脊髓丘腦束神經元[2, 32]。我們由此提出假設，心源性顱面部疼痛可能涉及到脊髓頸段及三叉腦干感覺核復合體神經元的激活，三叉神經脊束核神經元的活化尤為關鍵。

c-Fos是即刻早基因中的一種，正常情況下，c-Fos在多數(shù)神經元中有低水平表達，細胞內c-Fos蛋白很少，不易檢測到，但在接受刺激后表達水平可以迅速而短暫提高, 根據(jù)c-Fos可以被刺激誘導快速短暫表達的特性, 其產物c-Fos蛋白可作為中樞神經元興奮活化的標志[33]，筆者從大鼠心包腔反復注入或抽出IES復制心絞痛模型，運用免疫組化方法，以神經元活化為線索，觀察大鼠脊髓和腦干神經元c-Fos表達，尤其關注大鼠腦干三叉神經感覺核復合體神經元c-Fos的表達，試圖為臨床上部分心肌缺血患者顱面部疼痛是其的唯一癥狀提供實驗依據(jù)。

在心肌缺血期間，心迷走和心交感神經的傳入纖維均被激活[34-35]，先前諸多研究已表明，通常情況下，心交感神經的傳入沖動進入上段胸髓和頸髓[2, 4, 20, 32]，進而引起STT神經元的興奮[2, 13, 16-17, 21, 32]，與心絞痛患者出現(xiàn)左前胸壁疼痛，并放射到手臂有關。這些實驗結果可以解釋心臟疼痛時由上段頸髓支配區(qū)域潛在的牽涉痛發(fā)生的神經生理機制[2, 37]。然而，臨床上有部分心肌缺血患者，顱面部疼痛是其唯一的癥狀[22]，并且該種顱面部疼痛不是齒源性的[27]，確與其牽涉到相同位置，由于對其病理發(fā)生和發(fā)展機制缺乏有效的了解，給臨床上的及時診斷和治療增加了難度[31]。心肌缺血的敏感傳入神經元的激活是由心肌缺血相關的疼痛信號傳遞引發(fā)的[3, 38]，既往的研究表明，上頸段脊髓(在C1～2節(jié)段)對心肌缺血的敏感傳入神經元的信號傳遞整合中發(fā)揮著重要作用[1-2]。

我們的實驗結果顯示，同sham 組和saline 組大鼠相比，IES組大鼠C2段脊髓背角I-V層c-Fos陽性神經元數(shù)量顯著增加，由此說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)傳至中樞C2段脊髓，同時我們還觀察到IES組大鼠c-Fos陽性神經元數(shù)量在三叉神經脊束核尾部(Sp5C)也明顯增多(P<0.05)，說明向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)由中樞C2段脊髓傳至三叉神經脊束核尾部(Sp5C)，介導該信號的主要位于三叉神經脊束核尾部的膠質細胞層。用育亨賓和納絡酮預處理20 min，IES組大鼠Sp5C腹側邊c-Fos陽性神經元的表達未受影響，初步證實向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛的中樞信號上傳過程中未發(fā)現(xiàn)α2-腎上腺素受體和阿片受體的參與。

此外，與sham 組和saline 組大鼠比較，IES組大鼠呈圓錐體狀的三叉神經感覺核復合體自前囟到對耳線Pr5VL、Sp5O 和Sp5I c-Fos陽性神經元的數(shù)量逐漸增加，同樣證實向大鼠心包腔反復注入或抽出IES的信號通過心臟感覺傳入神經纖維(包括心交感和心迷走纖維)由中樞脊髓傳至三叉神經脊束核尾部(Sp5C)，再傳至三叉神經感覺核復合體，自前囟到對耳線Pr5VL、Sp5O 和Sp5I c-Fos陽性神經元的數(shù)量逐漸增多，因為心臟位于大鼠胸腔偏左側，故c-Fos陽性神經元數(shù)量左側多于右側。

眾所周知，心肌自身代謝水平是調節(jié)冠脈血流量的最主要因素，而心肌的各種代謝產物中，腺苷所起的作用最重要。腺苷作為一種內源性嘌啶核苷，在生理和病理條件下都具有重要作用。IES包括腺苷、緩激肽、前列腺素E2、5-羥色胺和血清素構成的混合物，成分非常復雜，其中腺苷濃度最高，我們認為，通過向大鼠心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛模型獲得中樞神經元激活的變化，在上調中樞三叉神經脊束核神經元c-Fos表達信號通路中，腺苷可能發(fā)揮了重要的信號轉導分子作用，至于其確切機制有待今后進一步探討。

總之，我們實驗表明，通過向大鼠向心包腔反復注入或抽出IES復制大鼠心絞痛模型可以激活三叉神經脊束核心肌缺血的敏感傳入神經元，不是通過阿片受體和α2-腎上腺素受體介導的。據(jù)此，我們通過實驗性心肌缺血心絞痛動物模型，證實了此種疼痛可以轉移到顱面組織，為臨床上部分心肌缺血患者顱面部疼痛作為唯一癥狀提供了實驗依據(jù)。

[致謝： 鶴岡正吉準教授和前田昌子講師(昭和大學，日本)對整個實驗的指導把關，郭試瑜準教授(昭和大學，日本)對文稿提出的批評指正，作者一同致謝！]

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