莊穎峰，張旭鳴，許 瑋，林世水，邱美光，林志毅

·論 著·

髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后異位骨化的蛋白質(zhì)組研究

莊穎峰，張旭鳴，許 瑋，林世水，邱美光，林志毅

目的 使用蛋白質(zhì)組方法，通過比較髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后并發(fā)異位骨化與未并發(fā)異位骨化患者血清蛋白，尋找差異表達蛋白，篩選蛋白質(zhì)標志物。方法 收集2009年8月～2012年3月14例髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者血清，以髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后并發(fā)異位骨化(heterotopic ossification,HO)記為HO組，以未并發(fā)異位骨化為正常組，蛋白質(zhì)芯片聯(lián)合表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜 ( SELDI-TOF-MS) 技術(shù)檢測分析兩組蛋白質(zhì)表達譜，尋找差異蛋白。對每個質(zhì)荷比峰值進行Wilconxon秩和檢驗，篩選P<0.05的差異蛋白質(zhì)峰。結(jié)果 檢測到154個高質(zhì)量質(zhì)譜蛋白質(zhì)峰，其中質(zhì)荷比為2748的蛋白點的峰值較正常組明顯下調(diào)，匹配蛋白質(zhì)為α-2-HS糖蛋白B鏈(Alpha-2-HS-glycoprotein chain B，AHSG B-鏈)。結(jié)論 AHSG B-鏈的低表達與髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后并發(fā)HO密切相關(guān)，可能為HO的敏感蛋白質(zhì)標志物。

髖關(guān)節(jié)置換； 異位骨化； 蛋白質(zhì)組； 胎球蛋白

我國國內(nèi)自20世紀80年代開展髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(hip arthroplasty,HA)以來，隨著關(guān)節(jié)外科技術(shù)的日漸成熟，HA在臨床上也得到越來越廣泛的應(yīng)用，其并發(fā)癥也越來越受重視。異位骨化(heterotopic ossification，HO)導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛及活動受限，已經(jīng)成為HA術(shù)后的常見并發(fā)癥[1-2]； 嚴重的異位骨化導(dǎo)致患髖強直，關(guān)節(jié)功能喪失，髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)失敗，對患者的生活質(zhì)量造成了負面影響。Stoltny等[3]認為90%的全髖關(guān)節(jié)置換患者都存在發(fā)生HO的高危因素。全髖關(guān)節(jié)置換患者術(shù)后HO的發(fā)病率在5%～90%[4]。由于HO的病因與病理機制尚未完全了解，臨床上需要尋找更為敏感的蛋白質(zhì)標記物以做出早期診斷。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析HA術(shù)后并發(fā)HO的患者與正常HA術(shù)后患者，尋找兩者之間的差異表達蛋白。希望所發(fā)現(xiàn)的差異表達蛋白能為HO的發(fā)生做出早期診斷，解析其發(fā)病機制，進而發(fā)現(xiàn)HO的特異蛋白質(zhì)標記物。

材料與方法

1 標本

收集2009年8月～2012年3月14例髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者血清，其中并發(fā)異位骨化7例，記為HO組； 未并發(fā)異位骨化7例，記為正常組。HO組病例入選標準： (1) HA術(shù)后早期出現(xiàn)的髖周持續(xù)性疼痛、輕度腫脹； 不同于傷口痛，無髓內(nèi)感染征象; 病程進展，關(guān)節(jié)運動逐漸減小。(2) X線隨訪發(fā)現(xiàn)HO病灶,其Brooker分型[5]均為Ⅰ型; (3) 無嚴重肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和精神病者。14例HA患者手術(shù)切口均取后外側(cè)入路。HO組及正常組中全髖關(guān)節(jié)置換各4例； 人工股骨頭置換各3例。性別及年齡構(gòu)成： HO組男性6例，女性1例; 平均年齡66.7歲； 正常組男性6例，女性1例； 平均年齡63.3歲。兩組間性別、年齡相當。

采集研究對象的外周靜脈血5ml，共14份。在無抗凝劑的10ml普通采血試管中室溫靜置1～2h，使血液凝固析出血清，2 000rpm離心5min，取其上清液加入Eppendorf管，-80℃低溫冰箱保存。

2 方法

2.1 主要儀器設(shè)備與試劑 蛋白核酸測定儀(Biophotometer 6131，德國Eppendorf公司)； PBS-Ⅱ-PLUS型SELDI-TOF-MS系統(tǒng)(美國Ciphergen Biosystem 公司)； 96孔蛋白質(zhì)芯片工作平臺(Bio-processor，美國Ciphergen Biosystem 公司)； 全自動酶標讀數(shù)儀(ELX808，美國Bio Tek公司)； 50%乙腈； 50mol/L乙酸鈉； 9mol/L尿素(美國Sigma公司)； 2%3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid,CHAPS，美國Sigma公司)、1%二硫代蘇糖醇(trifluoro-acetic acid，TFA，美國Sigma公司)、0.5%三氟乙酸(美國Sigma公司)。

2.2 血清與芯片的預(yù)處理 冰浴上30～60min內(nèi)緩慢溶解實驗組及對照組血清，4℃下10 000rpm離心4min。每5μl血清加入10μl U9血清變性溶液(9mol/L尿素，2%CHAPS，1% DTT配制而成)，4℃下600rpm搖床上振蕩30min使充分混合。以CM10芯片結(jié)合緩沖液(乙酸鈉2.051g溶于去離子水中，HCL調(diào)節(jié)pH值至4.0，定容為500ml，由此配制成50mmol/L乙酸鈉)將U9處理后的血清稀釋至200μl，搖床上振蕩使充分混合(600rpm，4℃，2min)。血清被稀釋約40倍。每孔CM10芯片中加入200μl結(jié)合緩沖液，室溫下?lián)u床600rpm震蕩5min，使充分平衡后去除液體，重復(fù)平衡1次。

2.3 蛋白質(zhì)與芯片結(jié)合及結(jié)合后的處理 取上述經(jīng)U9處理并稀釋過的血清100μl加到芯片上，仔細檢查并去除每個孔中的氣泡以免其影響蛋白質(zhì)與芯片的結(jié)合。芯片與血清充分反應(yīng)1h(600rpm搖床上振蕩，4℃)后去除樣品。每孔加入200μl相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，搖床上振蕩5min(600rpm，室溫)后除去液體。重復(fù)該過程2次。用水(純度HPLC級)200μl快速清洗每個孔1次，用力甩干并將生物處理器倒扣在清潔的吸水紙上輕拍以去除多余的水。將芯片從生物處理器中取出，自然干燥。每孔點加50%飽和的SPA溶液(SPA的溶劑為50% H2O+50%乙腈+0.5% TFA。將SPA溶解于其溶劑中直至過飽和，13 000rpm離心1min后取上清液，與溶劑1∶1混合即可)1μl，待其自然干燥后重復(fù)點加1次。自然干燥即可上機檢測。

2.4 SELDI質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置及原始數(shù)據(jù)采集和輸出 首先用已知分子量的標準蛋白質(zhì)芯片將SELDI質(zhì)譜系統(tǒng)的分子量誤差校正到<0.1%，再將結(jié)合好蛋白質(zhì)的芯片放入質(zhì)譜儀中進行檢測。原始數(shù)據(jù)由Proteinchip Software 3.2軟件采集，設(shè)置激光強度為180，檢測靈敏度6，檢測上限100 000m/z，優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2 000～20 000m/z，信號收集位置從20～80，每個樣本取168個點所收集信號的平均值。用Proteinchip Software 3.2軟件將原始數(shù)據(jù)以xlm的格式輸出。

3 數(shù)據(jù)處理與匹配蛋白質(zhì)的查找

實驗數(shù)據(jù)采用由本研究建立的ZJU-PDAS(ZheJiang University-ProteinChip Data Analyze System)軟件分析。原始質(zhì)譜圖上傳到服務(wù)器,先用小波變換(Undecimated Discrete WavISRt Transform，UDWT)去除質(zhì)譜儀器本身造成的噪音,修正去除噪音后的質(zhì)譜圖的基線。校正整個圖譜的分子量值，用局部極值法找出蛋白值峰，并過濾掉信噪比<4的峰。這時從每個樣本中找出來的峰的個數(shù)及其本身的質(zhì)荷比值都不相同。將各個樣本中質(zhì)荷比的差異<0.3%的峰聚為一類。將聚類后只出現(xiàn)在<10%的樣本中的峰去掉。再對找出的峰在各個樣本中的強度做均一化處理。對預(yù)處理完篩選出來的蛋白質(zhì)峰做進一步的檢驗分析，Wilconxon秩和檢驗篩選P值<0.05的差異蛋白質(zhì)峰。 根據(jù)差異蛋白質(zhì)峰所對應(yīng)的質(zhì)荷比，結(jié)合芯片提供的等電點范圍，檢索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的蛋白質(zhì)信息； 從而獲得蛋白質(zhì)名稱、基因名稱、蛋白質(zhì)功能、亞細胞定位及組織特異性等信息。

結(jié) 果

共檢測到154個經(jīng)過信噪比和強調(diào)過濾的高質(zhì)量質(zhì)譜蛋白質(zhì)峰。其中質(zhì)荷比為2748的蛋白點的峰值較正常組明顯下調(diào)(表1和圖1)，與正常組之間差異有顯著意義(P<0.05)。

表1 HO組與正常組差異蛋白質(zhì)峰

圖1 HO組與正常組CM10芯片蛋白質(zhì)組表達譜比較(質(zhì)荷比為2748的蛋白點)。檢索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，質(zhì)荷比為2748、等電點范圍為4～14的蛋白點的匹配蛋白質(zhì)為： AHSG B-鏈

討 論

1 AHSG B-鏈的結(jié)構(gòu)與功能

AHSG B-鏈是三糖(半乳糖、N-乙?；肴樘前?、O-糖苷)所組成的唾液酸，其多肽鏈部分由27個氨基酸殘基組成，含有2個β-折疊[6]。AHSG B-鏈通過1個二硫鍵與AHSG A鏈結(jié)合而形成胎球蛋白(AHSG)。AHSG B-鏈由肝臟合成并分泌入血，并有選擇地集中于骨基質(zhì)； 牙本質(zhì)中含量高于血漿蛋白。功能上具有鋇離子與鈣離子親和力，具有調(diào)理作用，可促進細胞內(nèi)吞，影響骨礦物相。

2 AHSG在正常骨礦化中的作用

Saunders等[7]的一項動物實驗發(fā)現(xiàn)，綿羊胎兒的骨與軟骨組織如骨表面、骨髓中的AHSG呈高表達，表明AHSG可能在胎兒的骨與軟骨的發(fā)育中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒的血清AHSG水平遠高于出生后，胎齡90d的牛胎兒AHSG水平約為20mg/ml，而成年母牛的AHSG水平約為1mg/ml[8]，AHSG水平的明顯變化提示其在胎兒的生長發(fā)育中起重要作用。美國的一項研究發(fā)現(xiàn)，健康社區(qū)老年婦女(年齡70～79歲)血清AHSG水平與髖關(guān)節(jié)或腰椎骨密度密切相關(guān)，AHSG水平每提高平均0.38mg/ml，其髖關(guān)節(jié)的骨密度測定值就增高0.016g/cm2[9]。Hamlin和Price[10]將脫鈣的骨骼置于血清中，觀察到重新礦化現(xiàn)象； 但置于含生理濃度的鈣、磷溶液中就無法被重新礦化。Toroian和Price[11]更進一步觀察到血清中去除AHSG后將無法使去礦化的骨骼重新礦化； 但加入AHSG后骨骼礦化發(fā)生了。這些實驗有力地闡明了AHSG在骨礦化中的作用，但其機制尚未完全明確。Price等[12]提出了“抑制劑排除”的假說來解釋AHSG的體外促礦化作用： 作為強效的鈣、磷礦化抑制劑，AHSG在Ⅰ型膠原纖維的外部抑制了羥基磷灰石晶體的形成； 但AHSG不能進入Ⅰ型膠原纖維內(nèi)部，因而不能與骨礦化基本位點相結(jié)合，故Ⅰ型膠原纖維的礦化過程不受抑制。德國最近研究表明AHSG生理作用還表現(xiàn)為防止骺端軟骨基質(zhì)過度礦化，該研究發(fā)現(xiàn)AHSG基因敲除小鼠(AHSG-/-)的肢體長骨發(fā)育嚴重障礙、骺板早閉，但其長骨生長面骨密度明顯增加[13]。另外，AHSG在人體內(nèi)的作用由于涉及細胞等機體內(nèi)、外環(huán)境而更為復(fù)雜，其生理功能的發(fā)揮可能與血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞等有關(guān)。

3 AHSG在異常骨礦化中的作用

人體的正常的礦化過程僅發(fā)生于骨骼及牙齒。病理性鈣化過程發(fā)生于全身所有的軟組織，最常見于脈管組織； 發(fā)生于軟組織內(nèi)的成熟板狀骨即為HO。組織的礦化過程為下列3個因素的相互作用： 鈣磷濃度、適合礦化的環(huán)境以及鈣化抑制因子的水平[14]，任何一種因素的失調(diào)將可能導(dǎo)致異位骨化、血管鈣化的發(fā)生。機體內(nèi)的礦物沉積必須有序進行并精確調(diào)節(jié)。AHSG可與血液循環(huán)中的堿性磷酸鈣等礦物鹽結(jié)合形成水溶性的鈣-蛋白顆粒(calciprotein particles,CPPs)，以防止礦物在人體內(nèi)互相聚集而過度礦化，從而執(zhí)行其抑制礦化作用。CPPs的礦化過程經(jīng)歷了2個階段： 初級CPPs為直徑約50nm的球形顆粒，由AHSG單體(鈣、磷等礦物離子聚集成簇，形成礦化前體，再與AHSG聚合成AHSG單體)聚集而成； 室溫下，初級CPPs經(jīng)歷數(shù)小時的結(jié)構(gòu)重排形成次級CPPs，直徑擴大了約2倍，顆粒形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楠M長狀； 顆粒核心的AHSG單體聚集更為緊密以確保次級CPPs能持續(xù)數(shù)天而保持狀態(tài)穩(wěn)定，充足的時間有利其生理功能的發(fā)揮[15]。過量的含鈣、磷等礦化物質(zhì)的CPPs必須被清除，以防止礦化物質(zhì)在軟組織中的異常沉積。Herrmann等[16]的另一項研究提供令人信服的證據(jù)表明，小鼠肝臟枯否細胞及脾臟邊緣的巨嗜細胞能夠通過A類清道夫受體(scavenger receptor-A，SR-A)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)迅速地清除CPPs。最近的一項研究首次發(fā)現(xiàn)，CPPs能夠誘導(dǎo)網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)表達與分泌TNF-α及IL-1β，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，啟動細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡，導(dǎo)致病理性鈣化[17]。

總之，AHSG水平較低或CPPs水平較高都可能導(dǎo)致病理性鈣化[14]。我們的蛋白質(zhì)組研究首次發(fā)現(xiàn)AHSG B-鏈的低表達與HA置換術(shù)后并發(fā)HO密切相關(guān)，可成為HO的敏感蛋白質(zhì)標志物。由于AHSG B-鏈的低表達，導(dǎo)致礦物鹽在髖關(guān)節(jié)周圍的軟組織周圍異常礦化而出現(xiàn)HO。由于本研究樣本量較少，可能存在一定的誤差，今后的研究需進一步加大樣本量。同時我們認為，HO患者血清中AHSG B-鏈的低表達與AHSG低表達具有正相關(guān)性，但仍需后續(xù)的研究進一步明確。

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(本文編輯： 賀 羽)

Proteomics study on heterotopic ossification after hip arthroplasty

ZHUANGYing-feng1,ZHANGXu-ming1,XUWei1,LINShi-shui1,QIUMei-guang1,LINZhi-yi2

(1.Department of Emergency Surgery，Provincial Clinical College of Fujian Medical University，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China； 2.Department of Nuclear Medicine，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China)

Objective The paper aims to seek the differentially expressed proteins and sensitive biomarker in the serum of the patients with heterotopic ossification (HO) after hip arthroplasty through comparing with the normal control group which did not occur heterotopic ossification by proteomic analysis. Methods The samples were divided into two groups: HO group and control group. The change of expressions of all proteins was assayed and analyzed by protein array and surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) proteomics technology to seek the differentially expressed proteins. The ratios of mass/charge (m/z) of each peak were tested by Wilconxon rank sum test to seek the protein peak withP<0.05. Results Totally 154 high-quality mass spectrometry protein peaks were detected. The expressions were down-regulated in the protein spot with m/z of 2748 and the matching protein was Alpha-2-HS-glycoprotein chain B (AHSG B-chain). Conclusion The low AHSG B-chain level is closely relative to HO after hip arthroplasty and may be the sensitive biomarker of HO.

hip arthroplasty; heterotopic ossification; proteomics; fetuin

1009-4237(2014)02-0147-04

福建省衛(wèi)生廳青年科研項目基金資助(2010-2-11)

350001 福建 福州，福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院、 福建省立醫(yī)院急救中心外科(莊穎峰，張旭鳴，許瑋，林世水，邱美光)，核醫(yī)學(xué)科(林志毅)

R 687.4

A

2013-05-16；

2013-09-09)