周鳳嬌，蘇彥君，張麗坤，張建勇，安志霞

(河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

青蒿素對糖尿病大鼠腎組織NF-κB的DNA結(jié)合活性升高的抑制作用

周鳳嬌，蘇彥君，張麗坤，張建勇，安志霞

(河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

目的 探討青蒿素對實驗性糖尿病大鼠腎組織核因子-κB(NF-κB)的DNA結(jié)合活性升高的抑制作用。方法 選擇雄性SD大鼠15只，隨機分成正常對照組(A組)、糖尿病組(B組)及青蒿素治療組(C組),采用腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg方法建立糖尿病大鼠模型。C組給予青蒿素300 mg/(kg·d)腹腔注射。于實驗第4周應用電泳遷移率改變分析(EMSA)法檢測3組大鼠腎皮質(zhì)細胞NF-κB的DNA結(jié)合活性，并觀察實驗大鼠腎臟的病理學變化。結(jié)果 B組大鼠腎細胞NF-κB的DNA結(jié)合活性顯著上調(diào)；C組NF-κB的DNA結(jié)合活性顯著較B組下降，腎臟組織的病理學損傷亦減輕。結(jié)論 青蒿素可明顯改善糖尿病大鼠腎臟組織病理學改變，通過抑制糖尿病大鼠腎臟組織細胞NF-κB的DNA結(jié)合活性上調(diào)可能是相關作用機制之一。

糖尿病腎病；青蒿素；NF-κB；電泳遷移率改變分析

近年來流行病學研究表明，糖尿病發(fā)病率在全球迅速上升，使糖尿病腎病(DN)發(fā)病率逐年增加，目前在發(fā)達國家，糖尿病腎病已成為引起終末期腎衰竭(ESRD)的首要原因。高糖環(huán)境下眾多因素可導致腎組織細胞增生肥大，從而啟動糖尿病腎病早期病變。如何逆轉(zhuǎn)增生肥大的腎組織細胞成為防治早期糖尿病腎病的關鍵問題之一。近年來大量研究證明，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB磷酸化激活后調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄，從而使腎組織細胞產(chǎn)生多種生長因子和細胞因子，參與腎組織細胞增生肥大，啟動早期糖尿病腎病的發(fā)生，并參與病情進展[1-3]。本實驗通過糖尿病大鼠腹腔注射青蒿素，觀察青蒿素對糖尿病大鼠腎臟組織細胞NF-κB的DNA結(jié)合活性升高的影響，為糖尿病腎病的臨床防治提供新的研究途徑和干預手段。

1 實驗資料

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量180～220 g；STZ購自Sigma；青蒿素購自成都偉輝生物科技有限公司；NF-κB雙鏈寡核苷酸、T4多核苷酸激酶、凝膠移位測定系統(tǒng)購自Promega公司；抗P50、抗P65多克隆抗體購自圣克魯斯生物技術公司；達優(yōu)血糖儀購自廣州達優(yōu)醫(yī)療設備有限公司。所用緩沖液配方，buffer A (pH 7.9):0.5% NP-40,10 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,1.5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L DTT,0.5 mmol/L PMSF;buffer B:buffer A中去掉NP-40;buffer C(pH 7.9):0.5 mmol/L PMSF,10 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,20%甘油,0.2 mmol/L EDTA,20 mmol/L HEPES,0.5 mmol/L DTT;buffer D:KCl為400 mmol/L，余成分同buffer C。Gel loading buffer(10×)：0.2%溴酚藍,40%甘油；TE buffer:10 mmol/L Tris base,1 mmol/L EDTA；高滲裂解液(pH 8.0)：24 mmol/L EDTA,75 mmol/L NaCl。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及用藥 實驗大鼠隨機分為正常對照組(A組)、糖尿病組(B組)及青蒿素治療組(C組)，每組5只。采用大鼠腹腔單劑量注射STZ 65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，對照組只腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液。72 h后采集大鼠尾靜脈血，使用達優(yōu)血糖儀測血糖，血糖≥16.7 mmol/L表明實驗用動物模型成功。青蒿素溶于二甲基亞砜(DMSO)中，從造模成功當天起，C組大鼠予以腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)，A組與B組大鼠分別給予等量DMSO腹腔注射。實驗大鼠均自由飲水及進食，都不應用任何降糖藥物。

1.2.2 提取大鼠腎臟核蛋白成分 在實驗進行到第4周時，各組實驗大鼠予以處死。將實驗大鼠右側(cè)腎臟進行分離以后，切開腎靜脈和動脈，在0～4 ℃環(huán)境下，采用0.1 mol/L PBS沖洗右側(cè)腎臟，灌洗5 min。去掉右側(cè)腎臟腎包膜，留取右側(cè)腎臟部分腎皮質(zhì)，質(zhì)量300 mg，采用0.1 mol/L PBS在冰浴上漂洗，漂洗時間約3 min。之后再用3 mL buffer A將右側(cè)部分腎臟皮質(zhì)勻漿，再轉(zhuǎn)離心管內(nèi)冰浴10 min,低溫離心10 min后，棄掉上清液，再加4 mL buffer B，混合均勻，再次低溫離心10 min，棄掉上清液，加400 μL buffer B，混合均勻后予以冰浴30 min，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)予以低溫20 000 g離心，時間15 min，留取上清液，此即為腎組織細胞核蛋白成分，將其放入離心管內(nèi)-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 同位素標記結(jié)合探針 NF-κB雙鏈探針的堿基序列為：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，其5'-末端采用T4多核苷酸激酶予以標記[γ-32P]ATP，應用乙醇沉淀獲取純化標記的寡核苷酸探針。詳細步驟操作均按照說明書進行。

1.2.4 電泳遷移率改變分析 ①對照反應：設陰性對照和陽性對照。②特異性抑制結(jié)合反應：反應體系中需加入1.75 pmol未標記NF-κB探針。非特異性抑制結(jié)合反應：反應體系中加入1.75 pmol未標記AP-2探針。③抗體結(jié)合實驗：反應體系中加入2 μg抗P50、抗P65多抗。④檢測實驗大鼠腎組織細胞NF-κB的DNA結(jié)合活性。5 μg核蛋白加入反應體系中，加入1.75 fmol標記NF-κB探針。具體步驟操作均嚴格按照說明書展開。反應產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，后-70 ℃予以放射自顯影，時間48 h。采用軟件分析電泳譜帶，以吸光度與凝膠譜帶面積乘積代表NF-κB的活性。

1.2.5 腎組織細胞病理改變 留取適量右腎皮質(zhì)，予以10%甲醛溶液浸泡固定，制備石蠟切片，染色后光學顯微鏡下觀察腎組織細胞病理改變。

2 結(jié) 果

2.1 NF-κB探針與NF-κB結(jié)合具有序列上的特異性 陽性對照反應證實所采用的實驗手段能成功檢測NF-κB與DNA結(jié)合的復合物。未標記NF-κB探針濃度達標記NF-κB探針濃度100倍時，可完全抑制蛋白與DNA復合物形成。同樣濃度未標記的AP-2探針沒有此種抑制作用?？筆50、抗P65多抗均導致蛋白-DNA復合物的超遷移，證實此復合物內(nèi)存在NF-κB蛋白。

2.2 各組大鼠腎組織細胞NF-κB活性比較 NF-κB的DNA結(jié)合活性A組為189±19.21，B組為817±17.91，C組為376±20.71。B、C組活性明顯高于A組，但與B組比較，C組活性明顯下降，說明糖尿病大鼠腎細胞NF-κB活性顯著上升(F=3 715.268,P=0.000)，青蒿素治療組糖尿病大鼠腎細胞NF-κB的活性明顯被抑制(P<0.01)。

2.3 實驗大鼠腎細胞病理學改變 光學顯微鏡下，A組大鼠的腎小球毛細血管襻薄，腎小管結(jié)構未見明顯異常；B組大鼠腎小球的面積變大，系膜區(qū)面積變寬，并且基底膜明顯變厚，腎小管未見明顯病變，且腎小球未見硬化；C組大鼠腎小球病理改變較對照組重，但明顯輕于B組。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，目前其發(fā)病機制尚不完全清楚。研究表明，炎癥在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，它是促進糖尿病血管病變的關鍵[4]。糖尿病腎病時腎臟的固有細胞、炎癥細胞合成和分泌多種炎癥遞質(zhì)如NF-κB、IL-6等，參與炎癥反應，導致腎病的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB是炎癥啟動、調(diào)節(jié)的關鍵核因子，不僅參與了多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，其活化后還能誘導許多因子的轉(zhuǎn)錄。 目前研究證明受NF-κB調(diào)控的基因主要有內(nèi)皮素-1(ET-1)、白細胞介素-1(IL-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及血小板衍化生長因子(PDGF)等。此類細胞因子可組成龐雜的細胞因子網(wǎng)絡，引起腎細胞肥大以及增殖，并使組織細胞膠原蛋白降解減少而其合成卻增加，最終導致細胞外基質(zhì)(ECM)增加，并發(fā)生病理性重建，啟動早期糖尿病腎病的發(fā)生，并參與病情進展[5-7]。

近年來大量研究證實青蒿素具有廣泛的藥理作用，主要為抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化的作用[8-9]。本實驗應用電泳遷移率改變分析方法，在體外證明了大于標記NF-κB雙鏈探針濃度100倍以上的未標記結(jié)合探針能有效阻斷蛋白-DNA復合物形成，而同樣濃度的AP-2未標記結(jié)合探針，由于其未含NF-κB的特異DNA序列而沒有此種抑制效果，抗P50、抗P65多抗均能引起蛋白-DNA復合物的超遷移，證明本研究應用的NF-κB探針特異性高，并且實驗方法準確，數(shù)據(jù)可靠。

本實驗表明，糖尿病大鼠腎組織細胞NF-κB的活性顯著上升，通過腹腔注射青蒿素，糖尿病大鼠腎組織細胞NF-κB的活性受到明顯抑制，并能緩解糖尿病大鼠腎臟病理學改變，減輕糖尿病大鼠腎皮質(zhì)功能損傷。

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Inhibitory effect of artemisinin on the upregulation of DNA-binding activity of NF-κB in kidney tissue of diabetic rats

Zhou Fengjiao, Su Yanjun, Zhang Likun, Zhang Jianyong, An Zhixia

(The Second Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to investigate the inhibitory effect of artemisinin on the upregulation of DNA-binding activity of NF-κB in kidney tissue of experimental diabetic rats. Methods 15 male SD rats were selected and randomly divided into 3 groups: normal control group(A group), diabetic group(B group)，artemisinin treatment group(C group). The diabetic rat models were established by intraperitoneal injection with STZ 65 mg/kg. Group C was given artemisinin 300 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection. The DNA-binding activity of NF-κB in the kidney cortex cells was detected by EMSA, while renal pathologic changes were observed after 4 weeks' treatment. Results The DNA-binding activity of NF-κB was significantly activated in renal cortices in group B, and the activity was partly reversed in group C. Accordingly, renal pathologic changes in group C were significantly improved. Conclusion Artemisinin can obviously improve the pathologic changes of renal tissue in diabetic rats, one of the correlated mechanism may partly through inhibiting the DNA-binding activity of NF-κB in renal cortices.

diabetic nephropathy; artemisinin; NF-κB; EMSA

周鳳嬌，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向為糖尿病腎病。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.19.009

R-332

A

1008-8849(2014)19-2075-03

2013-12-20