陳紅麗 呂潔麗 南文濱 劉 瑞 張 慧郭偉云 劉玲蓉 張其清 井長(zhǎng)勤*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)3(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復(fù)合支架的制備及體外性能研究

陳紅麗1呂潔麗2南文濱1劉 瑞1張 慧2郭偉云1劉玲蓉3張其清3井長(zhǎng)勤1*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)3(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

為改善組織工程支架材料內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足及分布不均的問(wèn)題，制備膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復(fù)合支架(SCFM)并研究其理化性質(zhì)及其BSA釋放行為。本研究中采用戊二醛交聯(lián)并冷凍干燥制備多孔膠原海綿支架，纖維蛋白與載BSA的PLGA微球混合后加入凝血酶，注入膠原膜中制備復(fù)合支架，研究支架形態(tài)學(xué)、孔隙率、機(jī)械強(qiáng)度等理化性質(zhì)；通過(guò)BCA試劑盒法測(cè)定支架內(nèi)部不同部位BSA含量及釋放行為，圓二色譜法檢測(cè)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。掃描電鏡結(jié)果顯示制備的膠原支架孔徑分布均勻,孔徑平均(130±45) μm；相對(duì)于膠原/纖維蛋白膠/BSA支架(SCFB)，在體外釋放48 h時(shí)累積釋放率為75.20%±2.74 %，隨后BSA即不再顯著增加；而支架SCFM中的BSA釋放時(shí)間延長(zhǎng)，持續(xù)釋放144 h，測(cè)定其累積釋放量為72.36%±3.48 %；測(cè)定支架SCFM代表性的3個(gè)部位的BSA含量均勻，在釋放96 h內(nèi)均高于支架外BSA含量，且圓二色譜結(jié)果表明BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。支架SCFM可長(zhǎng)時(shí)間維持支架內(nèi)部BSA含量，且持續(xù)均勻釋放，是理想的組織工程支架材料。

膠原；纖維蛋白；PLGA微球；組織工程支架

引言

支架(scaffold)材料在組織工程研究中起中心作用，它不僅為特定的細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐作用，而且還起模板作用，引導(dǎo)組織再生并控制組織結(jié)構(gòu)。膠原是一種天然蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物的皮膚、骨、肌腱韌帶和角膜等組織中，作為藥物載體及構(gòu)建活性三維支架已得到廣泛認(rèn)可[1-2]，但在體外培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到支架材料內(nèi)部并保持均一持續(xù)的作用。因此，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在支架中的可控制釋放及均一分布對(duì)于構(gòu)建三維組織工程支架尤為重要。在支架材料中復(fù)合定量的生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可為細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖提供養(yǎng)分。但膠原蛋白(collagen)只在酸性環(huán)境中溶解，在中性環(huán)境中由于膠原未能溶解分散，很難使水溶性的蛋白及細(xì)胞因子等營(yíng)養(yǎng)成分分散均勻，因而不能保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)均勻的釋放發(fā)揮作用；而膠原蛋白溶解的酸性環(huán)境易導(dǎo)致蛋白及細(xì)胞因子的失活。纖維蛋白(fibrin)具有良好的止血功能，但機(jī)械強(qiáng)度較差[3-6]；將載細(xì)胞因子的微球與纖維蛋白混合后，與膠原復(fù)合制備支架，可在一定程度上克服兩種材料的缺點(diǎn)[7-8]，復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞作為仿生皮膚覆蓋物用于修復(fù)皮膚缺損具有良好的應(yīng)用前景。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)聚乳酸-羥基乙酸共聚物((poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球及納米粒作為牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的載體可以保護(hù)其活性并延緩其釋放速率[9-10]。結(jié)合前期的研究成果，本研究以BSA作為細(xì)胞因子及蛋白多肽的模擬，先將BSA包裹制備成微球，然后與纖維蛋白及膠原復(fù)合制備膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復(fù)合支架(SCFM)，考察其形態(tài)學(xué)、機(jī)械強(qiáng)度等影響，并研究BSA體外釋放行為，支架內(nèi)不同部位BSA含量。重點(diǎn)考察支架內(nèi)部不同部位及釋放液中的BSA濃度及其隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，以及釋放后的BSA的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。期望制備的支架SCFM達(dá)到克服現(xiàn)有支架材料內(nèi)部細(xì)胞因子及其營(yíng)養(yǎng)成分活性低及分布不均而影響種子細(xì)胞在支架內(nèi)的分布不均的缺點(diǎn)，使組織工程支架材料真正達(dá)到三維支架的作用[11-15]。為構(gòu)建組織工程化人工器官的研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步開(kāi)展組織工程化人工器官的研究及臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

膠原(采用新鮮豬皮通過(guò)胃蛋白酶消化法自制，主要為I型膠原,含量>95%)、纖維蛋白膠(廣州倍繡生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、牛血清白蛋白(63 000～65 000，北京鼎國(guó)生物有限公司，中國(guó))、PLGA(MW30 000～70 000，50∶50，山東省醫(yī)療器械研究所，中國(guó))、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Pierce)、膠原酶(I型，125 U/mg，Sigma，美國(guó))、人纖溶酶(2 U/mg，Sigma，美國(guó))、其余試劑均為市售分析純。

低溫冷凍真空干燥機(jī)(Labconco，美國(guó))、掃描電鏡(Zeiss Supra 55VP，德國(guó))、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Spectramaxplus384，美國(guó))、圓二色譜儀(Jasco J2810，日本)。

1.2支架的制備

1.2.1膠原支架的制備

根據(jù)前期結(jié)果取0.6 %的膠原溶漲液冷凍干燥，通過(guò)戊二醛交聯(lián)后再次冷凍干燥，制備得到膠原海綿支架(SC)[2]。

1.2.2載BSA的PLGA微球的制備

采用液中干燥法制備微球[9-10,16]，簡(jiǎn)述如下：200 mg PLGA溶于4 mL二氯甲烷中，將0.5 mL含 BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)溶液轉(zhuǎn)入PLGA溶液中，乳勻后轉(zhuǎn)入1 %PVA溶液中，攪拌4 h，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后在15 000 r/min離心下收集微球，冷凍干燥，即得載BSA的PLGA微球。

1.2.3膠原/纖維蛋白膠/ 載BSA微球復(fù)合支架(SCFM)的制備

將載BSA的微球或BSA與纖維蛋白原(1∶10，w/w)混合均勻，在上述混合液中加入凝血酶后，立即加入制備好的支架SC中(纖維蛋白膠：膠原=1:3，w/w)，分別得到膠原/纖維蛋白/載BSA微球復(fù)合支架(SCFM)膠原/纖維蛋白/ BSA復(fù)合支架(SCFB)。

1.3形態(tài)學(xué)觀察及孔隙率測(cè)定

制備的支架材料置入液氮冷凍定型后，取出切成小試片，取其表面和截面置于金屬片上，真空噴金處理后，掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)和截面形貌，并測(cè)量每個(gè)支架的平均孔徑。

常溫下，25 mL 的刻度瓶加入無(wú)水乙醇至刻度，稱重記為m1，把重m的樣品浸入其中，24 h 時(shí)用吸管吸去刻度以上的無(wú)水乙醇，再稱重記為m2，把浸滿無(wú)水乙醇的樣品取出，稱量刻度瓶與剩余無(wú)水乙醇的質(zhì)量，記為m3。支架材料的孔隙率K表示為

(1)

1.4支架材料的吸水性測(cè)定、pH值及機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

取每種支架材料各5個(gè)樣品，精確稱重后，室溫下分別浸泡于PBS溶液中，2 h時(shí)取出支架，濾紙上吸去多余水分精確稱重，吸水率表示為

(2)

樣品分別放入試管內(nèi)，加入10 mL去離子水，將材料完全浸沒(méi)，振搖樣品使其分散，37℃下浸提72 h。用pH計(jì)測(cè)量各樣品浸提液和同等條件下靜置72 h雙蒸水的pH值。

取每種支架樣品各5個(gè)，剪成條狀，計(jì)算其表面積，用電子拉力試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸強(qiáng)度的測(cè)試(夾具間距為20 mm，拉伸速度為100 mm/min)，檢測(cè)其斷裂強(qiáng)度。

1.5BSA含量測(cè)定及結(jié)構(gòu)測(cè)定

精密稱取SCFM支架(10.00.5)mg，投入10 mL 釋放池中，釋放介質(zhì)為PBS(pH 7.2)，空氣浴振蕩器中(371)℃、(751) r/min振蕩，固定時(shí)間間隔，吸取支架三處(A，B，C)及釋放介質(zhì)液體(D)(取樣部位如圖3)各 25 μL，補(bǔ)充等量新鮮PBS，用微量BCA試劑盒測(cè)定BSA濃度，計(jì)算各部位釋放量以及累積釋放量，并繪制釋放曲線。

1.6支架SCFM降解后形態(tài)學(xué)觀察

精確稱取SCFM支架(10.00.5)mg放入試管，加入10 mL 降解介質(zhì)，降解介質(zhì)為含I型膠原酶(10 U/mg)和纖溶酶(0.1 U/mg)的PBS(pH 7.2)，空氣浴振蕩器中(371) ℃、(751) r/min振蕩，分別于48、96、144 h時(shí)取出后，冷凍干燥，掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)。為防止蛋白酶的降解失活，每隔48 h更新等體積新鮮降解介質(zhì)。每組取 3 個(gè)樣品，重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)量結(jié)果用SPSS11.0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，3種支架的釋放采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1材料的形貌結(jié)構(gòu)

載BSA的PLGA微球光滑圓整，無(wú)凝聚粘連等現(xiàn)象(見(jiàn)圖1)，粒徑為(22.4±6.2)μm，包封率為86.21%±2.31%，載藥量為7.65%±0.84%。將微球與纖維蛋白膠混合后可見(jiàn)分散均勻；加入膠原支架制備的復(fù)合支架SCFM中微球分散較均勻。圖1(c)所示的膠原支架SC的橫斷面，支架內(nèi)微孔彼此相通，三維結(jié)構(gòu)清晰，孔隙大小均一。SEM下標(biāo)尺測(cè)定支架材料的孔徑在100 ～200 μm。

2.2支架材料的吸水性能、pH值及機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

如表1所示，3種支架SCFM、SCFB和SC吸水率分別為44.25 %±4.645 %、45.67 %±5.143 %和48.34 %±4.65 %，未見(jiàn)明顯差異(P> 0.05)。經(jīng)過(guò)72 h浸泡后得到的各種浸提液和雙蒸水的pH值測(cè)定結(jié)果顯示，支架浸提液的pH值在中性范圍。浸提液pH值在6.7～7.1，與人體正常pH值范圍相符。3種支架材料的斷裂強(qiáng)度測(cè)量表明，纖維蛋白膠及微球的加入對(duì)于膠原支架斷裂強(qiáng)度未見(jiàn)顯著影響(P> 0.05)。

2.3BSA含量及釋放行為測(cè)定

如圖2所示，3種支架在最初的12 h內(nèi)均表現(xiàn)出突釋BSA效應(yīng)，支架SCFBBSA釋放量52.31%±2.36 %，SCFM與SCM分別為為26.30%±2.21 %，20.23%±2.04 %。在48 h時(shí)，SCFBBSA累積釋放量為75.20%±2.74 %，隨后釋放量未見(jiàn)明顯增加；SCM突釋BSA效應(yīng)小，釋放速率較慢，但是在96 h時(shí)BSA含量即不再增加。SCFM表現(xiàn)出緩慢較平穩(wěn)的釋放，48 h釋放量為40.92%±2.13 %，144 h時(shí)為72.36%±3.48 %。3種支架釋放行為采用組件方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P=0.027，具有顯著性差異。

圖1 支架掃描電鏡圖。(a)微球；(b)SCM；(c)SC；(d)SCFBFig. 1 SEM images of scaffold.(a)Microspheres；(b)SCM；(c)SC；(d)SCFB

表1支架材料(n=5,x±s)的孔隙率、pH值，機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果

Tab.1Porosity,pHandbreakingstrengthofdifferentkindsofscaffolds(n=5,x±s)

樣品孔隙/nm吸水率/%pH值斷裂強(qiáng)度/(N/mm2)SC150±5548 34±4 6506 89±0 760 564±0 010SCFB146±4045 67±5 1437 08±0 970 576±0 006SCFM130±4544 25±4 6456 78±1 230 570±0 012蒸水——7 24±1 46—

圖2 支架體外釋放BSA圖。(a)144 h累計(jì)釋放圖；(b)12 h累計(jì)釋放示意圖 (n=3)Fig.2 The release of BSA from scaffolds in vitro.(a)The release of BSA from scaffolds in 144 h;(b)The release of BSA from scaffolds in 12 h (n=3)

圖3 支架SCFM BSA含量.(a)不同部位BSA的濃度隨時(shí)間變化圖；(b)支架取材部位示意圖，其中A為支架圓心中部，B為半徑的中心，C為邊緣內(nèi)側(cè)，D為釋放介質(zhì))(n=3)Fig.3 BSA concentration in SCFM scaffolds.(a)BSA concentration in SCFM scaffolds；(b)Diagram of extracted from different parts of SCFM scaffolds， A: at the center of the scaffold; B: at the center of semidiameter; C: at the edge of scaffold; D: out release medium phase (n=3)

測(cè)定SCFM支架內(nèi)及釋放液中BSA的濃度(如圖3所示)，結(jié)果表明所選4處(A、B、C和D)不同部位的BSA 濃度隨時(shí)間不斷升高，并且支架材料內(nèi)A、B和C處濃度隨時(shí)間增速幾乎相同，其中24 h時(shí)各處濃度順序?yàn)镃A>CB>CC>CD(P<0.01)。96 h之前所測(cè)釋放液中BSA濃度均小于支架內(nèi)部各處(P< 0.05)。在144 h時(shí)支架各處濃度基本達(dá)到一致。支架A處、B處和C處分別與釋放液D處組間兩兩比較，P< 0.05，具有顯著差異。但是，A處、B處和C處任兩者之間組間比較沒(méi)有顯著性差異(P> 0.05)。

2.4BSA圓二色譜(CD)分析

圖5 支架SCFM體外降解一定時(shí)間時(shí)掃描電鏡圖。(a)48 h；(b)96 h；(c)144 hFig.6 SEM images of SCFM scaffold following in vitro degradation.(a)48 h；(b)96 h；(c)144 h

BSA的CD譜圖是典型帶有α-螺旋結(jié)構(gòu)的譜圖，即在222 nm和 208 nm附近處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶[17-18]。支架SCFM置于PBS溶液24 h和48 h時(shí)，由于不同時(shí)間釋放的BSA濃度不一致，與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)相比，釋放的BSA譜圖形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯移動(dòng)，釋放的BSA的CD光譜未發(fā)現(xiàn)異常，α-螺旋及β-折疊的含量分別與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)也未見(jiàn)明顯差異(P< 0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖4 支架SCFM 24和48 h時(shí)釋放液中BSA 圓二色譜儀圖Fig. 4 Criculardichroism spectra of BSA released from the SCFM scaffolds at 24 and 48 h

2.5支架SCFM降解后形態(tài)學(xué)觀察

在含有低濃度的膠原酶和纖溶酶的降解液中孵育一定時(shí)間，支架SCFM經(jīng)重新凍干后肉眼觀察都不同程度變得疏松柔軟，且表面粗糙。SEM觀察(見(jiàn)圖5)48 h時(shí)，支架SCFM仍保持較完整結(jié)構(gòu)，其中分布的PLGA微球呈現(xiàn)輕微的變形，但仍包裹于支架中；96 h時(shí)支架的空隙增大，其中微球已經(jīng)變形，可觀察到其中分部的完整的微球以及釋放一段時(shí)間后變形及聚集的微球，并且微球數(shù)量亦相應(yīng)減少，降解介質(zhì)中出現(xiàn)較多的絮狀沉淀；體外降解144 h時(shí)，肉眼觀察支架疏松多孔，且失去固定形態(tài)，SEM觀察支架SCFM空隙多而大，當(dāng)中微球已經(jīng)較少，鏡下幾乎不可見(jiàn)。

3 討論

膠原可制備成多孔結(jié)構(gòu)材料是其可用于組織工程支架材料的一個(gè)突出特點(diǎn)。支架材料給細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的三維生長(zhǎng)空間，并保持足夠的孔隙率，供細(xì)胞在其中進(jìn)行物質(zhì)交換、生長(zhǎng)代謝、引導(dǎo)組織形成[2]。制備的支架材料孔徑分布均勻，且支架內(nèi)部孔徑相互貫通，因此保證種子細(xì)胞在支架材料上的黏附、增殖和分化不受影響。復(fù)合支架材料具有有一定的機(jī)械強(qiáng)度、柔韌性。其酸堿性直接影響細(xì)胞的粘附以及生物相容性。盡管膠原分散在稀酸溶液中，但經(jīng)過(guò)兩次凍干以及堿性交聯(lián)液的作用，大大減少了酸性物質(zhì)的殘留。

在支架材料中復(fù)合定量的生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖提供營(yíng)養(yǎng)至關(guān)重要。但是支架內(nèi)部模擬體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)作用同樣關(guān)鍵。因?yàn)樽鳛槔硐氲慕M織工程支架，在組織工程支架材料上體外培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量主要表現(xiàn)在細(xì)胞與支架材料各處的黏附融合以及細(xì)胞在支架均勻的生長(zhǎng)、增殖情況[19]。本研究以BSA為蛋白模型，考察不同復(fù)合方式的支架內(nèi)BSA的濃度及釋放行為。支架SCFM中的BSA釋放時(shí)間延長(zhǎng)，持續(xù)釋放144 h，測(cè)定其累積釋放量為72.36%±3.48%，支架SCM突釋BSA效應(yīng)小，釋放速率較慢，但是在96 h時(shí)BSA含量即不再增加，推測(cè)是由于制備過(guò)程中，載BSA的微球需要較長(zhǎng)時(shí)間與膠原混合，因此導(dǎo)致微球表面的BSA損失，使得支架的BSA含量減少。24 h 支架SCFB出現(xiàn)第二個(gè)突釋效應(yīng)，推測(cè)是由于纖維蛋白膠的部分降解和崩解導(dǎo)致BSA的大量釋放；在48 h時(shí)，支架SCFBBSA累積釋放量為75.20%±2.74 %，隨后釋放量未見(jiàn)明顯增加。支架SCFM釋放液中BSA濃度在釋放96 h之前，均小于支架內(nèi)部各處(P< 0.05)，在144 h時(shí)支架各處濃度基本達(dá)到一致，也證實(shí)BSA釋放后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的擴(kuò)散及滲透才能達(dá)到各部位濃度均一。因此支架SCFM可長(zhǎng)時(shí)間維持支架內(nèi)部BSA含量，且持續(xù)均勻釋放，一定程度改善了僅靠培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用無(wú)法滿足接種在支架各處細(xì)胞融合、生長(zhǎng)、分化和代謝等，也一定程度改善了與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支架復(fù)合導(dǎo)致不能持久作用的缺點(diǎn)，從而克服了導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入支架內(nèi)部的缺陷。

由于I型膠原在體內(nèi)的特異性降解酶為I型膠原酶，而纖維蛋白膠在體內(nèi)纖溶酶作用下能夠降解并逐漸吸收。為了更好的模擬體內(nèi)局部體液環(huán)境，降解介質(zhì)選用pH7.2的 PBS，并且加入一定量的I型膠原酶和纖溶酶研究其降解過(guò)程中支架形態(tài)學(xué)變化，初步探索支架體外降解對(duì)于載BSA微球釋放的影響。在48h，96h時(shí)微球變形，但仍見(jiàn)大量的微球附著于支架內(nèi)，一定程度說(shuō)明在體外培養(yǎng)過(guò)程中可長(zhǎng)時(shí)間保持支架內(nèi)部微球的量即BSA的含量。膠原/纖維蛋白膠在體內(nèi)的降解與BSA的釋放時(shí)間密切相關(guān)，因?yàn)锽SA的釋放受濃度梯度和限制性生物可降解膜降解兩方面因素影響，膠原及纖維蛋白等生物材料的體內(nèi)降解受多種酶及環(huán)境因素的聯(lián)合作用，不完全等同于體外降解情況，體內(nèi)的釋放及其降解性質(zhì)還需要進(jìn)一步的研究。

蛋白質(zhì)分子構(gòu)象是其生物功能的基礎(chǔ)，多肽蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有復(fù)雜的一級(jí)結(jié)構(gòu)和嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)，任何導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)解體或松散以及損害三維結(jié)構(gòu)的因素都會(huì)影響其生物活性，圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。圓二色譜結(jié)果顯示釋放的BSA譜圖形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯移動(dòng)，α-螺旋及β-折疊的含量分別與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)也未見(jiàn)明顯差異(P< 0. 05)，證明支架內(nèi)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。推測(cè)其活性未受影響，保障了支架內(nèi)部持續(xù)均一且有活性營(yíng)養(yǎng)成分的作用。支架SCFM使其能更好地維持內(nèi)部活性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的持續(xù)穩(wěn)定性與均勻性。

4 結(jié)論

本研究制備的支架SCFM實(shí)現(xiàn)了BSA在支架中的長(zhǎng)時(shí)間較均勻分布，支架各部分BSA濃度均一，緩慢釋放，持久作用；調(diào)整微球的量可達(dá)到調(diào)整支架內(nèi)部BSA的含量，而且釋放的BSA結(jié)構(gòu)未見(jiàn)顯著改變，活性得到一定保護(hù)，保證了支架內(nèi)部持續(xù)均一且有活性營(yíng)養(yǎng)成分的作用。各種原料廉價(jià)易得，制備工藝簡(jiǎn)單，制備條件可控，表明支架SCFM是一種較理想的組織工程支架材料，可以保證種子細(xì)胞在支架材料上更好的黏附、增殖和分化。

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PreparationandinvitroCharacteristicsofCollagen/Fibrin/BSAMicrospheresComplexTissueEngineeringScaffolds

CHEN Hong-Li1LV Jie-Li2NAN Wen-Bin1LIU Rui1ZHANG Hui2GUO Wei-Yun1LIU Ling-Rong3ZHANG Qi-Qing3JING Chang-Qin1*

1(SchoolofLifeScienceandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)2(SchoolofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)3(InstituteofBiomedicalEngineering,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Tianjin300192,China)

In order to overcome the problem of nutrition insufficiency and inhomogeneous distribution in tissue engineering scaffolds, a scaffold (SCFM) composed of collagen/fibrin/BSA microspheres was prepared and the features were characterized, especially the release behaviors of BSA. Porous collagen scaffolds for tissue engineering were fabricated by freeze-drying and cross-linking. BSA loaded microspheres mixed with fibrin into collagen scaffolds for SCFM. The physiochemical properties of the scaffolds, such as surface morphology, porosity, pore sizes，mechanical function, and BSA contents in the scaffold were measured. SEM results showed that collagen scaffolds exhibited a highly porous and interconnected structure, the pore size of the material was (130±45) μm. Results of in vitro release tests revealed the BSA released from SCFMwas 72.36%±3.48% of the original amount of BSA encapsulated after 144 h. The cumulative release of BSA from collagen/fibrin/BSA scaffolds (SCFB) within 48 h was 75.20%±2.74 %. There were no significant changes in the further prolonged period after 48 h. The SCFMachieved a relatively constant release and prolonged BSA release properties as compared to the SCFB. It was found that BSA concentration inside of SCFMwas higher than the external release medium before 96 h. The conformations of the BSA from the SCFMdid not have significant changes. The SCFMobtained sustaining release ability and can maintain a homogeneous concentration of the BSA inside the scaffold for a long time. Therefore it provides a kind of promising scaffolds for tissue engineering.

collagen; fibrin; PLGA microspheres; tissue engineering scaffolds

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 01.012

2012-12-21，錄用日期：2013-08-20

河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011B310006)；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(122102210148，122102310195)

R318

A

0258-8021(2014) 01-0079-07

*通信作者。E-mail: jingchangqin@xxmu.edu.cn