高德全，張建波，王聯(lián)林，崔利軍

(1. 河北省平山縣人民醫(yī)院， 河北 平山 050400；2. 河北省平山縣北冶中心衛(wèi)生院，河北 平山 050403；3. 河北省平山縣小覺中心衛(wèi)生院，河北 平山 050400)

胃癌組織EZH2與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的關(guān)系及意義

高德全1，張建波1，王聯(lián)林2，崔利軍3

(1. 河北省平山縣人民醫(yī)院， 河北 平山 050400；2. 河北省平山縣北冶中心衛(wèi)生院，河北 平山 050403；3. 河北省平山縣小覺中心衛(wèi)生院，河北 平山 050400)

目的 探討胃癌組織中果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)關(guān)系及其臨床意義。方法 收集62例胃癌手術(shù)患者的腫瘤及52例癌旁正常胃黏膜組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)(SP)染色，同時檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，相關(guān)分析探討EZH2與這3種蛋白質(zhì)之間的關(guān)系及意義。結(jié)果 胃癌組織中EZH2、Bcl-2表達(dá)與癌旁正常組織比較明顯增強(qiáng)(P均<0.05)，Caspase-3、Bax蛋白在胃癌組織中表達(dá)較癌旁組織明顯降低(P均<0.05)；EZH2蛋白表達(dá)隨腫瘤分化程度降低而升高、隨分期的升高而升高；相關(guān)分析顯示，EZH2與Caspase-3、Bcl-2與Bax表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(P均<0.05)；其余蛋白之間表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 EZH2蛋白在胃癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，且與腫瘤分化程度及分期有關(guān)；EZH2蛋白參與胃癌的發(fā)病機(jī)制在于其可能通過抑制Caspase-3表達(dá)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞抗凋亡能力。

胃癌；果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2；凋亡相關(guān)蛋白

凋亡狀態(tài)異常是惡性腫瘤細(xì)胞的常見現(xiàn)象，惡性腫瘤細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的抗凋亡能力。與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)的主要有死亡受體途徑及線粒體途徑[1-2]，許多凋亡相關(guān)基因參與其中。由于胃癌凋亡調(diào)控機(jī)制極為復(fù)雜，目前尚未完全闡明。有研究表明，果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)可促進(jìn)多種惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展[3-5]，但迄今有關(guān)EZH2蛋白與胃癌細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究還不多見。因此，本研究應(yīng)用免疫組化(SP)法檢測了EZH2蛋白在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，同時檢測了與胃癌凋亡關(guān)系密切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2、Bax在胃癌中的表達(dá)，進(jìn)一步分析了EZH2蛋白與這些凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系，對EZH2蛋白在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用和意義進(jìn)行了初步探討。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2005年8月—2011年7月在平山縣人民醫(yī)院確診為胃癌行手術(shù)切除腫瘤并術(shù)后病理證實的胃癌患者石蠟標(biāo)本62例，其中52例有癌旁正常組織。所有患者臨床病理資料完整，患者術(shù)前均未接受放、化療，均有術(shù)后隨訪資料。其中男48例，女14例；年齡37～72(59.2±11.3)歲；高分化腺癌35例，低分化腺癌27例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期44例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色(SP)法檢測EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 兔抗人EZH2多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。SP試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明分別對胃癌腫瘤組織和癌旁正常組織進(jìn)行染色。染色結(jié)果由2位病理專業(yè)醫(yī)師分別進(jìn)行判定評分。每張切片均隨機(jī)取400倍視野5個，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色的陽性率計算評分。EZH2蛋白以細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色或棕褐色為染色陽性，Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白以細(xì)胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色或棕褐色為染色陽性。細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)率<10%記為(-)，陽性細(xì)胞表達(dá)10%～50%記為(+)，陽性細(xì)胞表達(dá)≥50%記為()。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用2檢驗、Spearman相關(guān)分析進(jìn)行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌、癌旁正常組織中EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 62例胃癌組織中EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)率分別為69%(43/62)、31%(19/62)、77%(48/62)、35%(22/62)；癌旁正常組織各蛋白表達(dá)陽性率分別為21%(11/52)、71%(37/52)、27%(14/52)、62%(32/52)。經(jīng)成組秩和檢驗比較，胃癌組織中EZH2、Bcl-2表達(dá)陽性率明顯高于癌旁正常組織(P均<0.05)，胃癌組織中Caspase-3、Bax表達(dá)陽性率明顯低于癌旁組織(P均<0.05)。見表1。

2.2 胃癌組織中EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與胃癌病理分化程度、臨床分期的關(guān)系 EZH2、Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度均隨腫瘤病理分化程度降低、臨床分期進(jìn)展而增強(qiáng)，Caspase-3、Bax表達(dá)則隨腫瘤病理分化程度降低、臨床分期進(jìn)展而減弱。見表2。

表1 胃癌和癌旁正常組織中EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)情況 例

表2 胃癌組織EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)與腫瘤分化程度及臨床分期的關(guān)系 例

2.3 胃癌組織中EZH2、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示：胃癌組織中EZH2與Caspase-3、Bcl-2與Bax間表達(dá)均具有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.378 4、-0.439 6,P=0.002、P=0.000 4)，EZH2與Bcl-2(r=0.224 3,P=0.080)、EZH2與Bax(r=0.115 8,P=0.370 1)、Caspase-3與Bcl-2(r=0.206 6,P=0.107 2)、Caspase-3與Bax(r=-0.186 8,P=0.146)之間關(guān)系均無相關(guān)性。

3 討 論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，該病發(fā)病較為隱匿,進(jìn)展轉(zhuǎn)移迅速，預(yù)后很差。關(guān)于胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，尚未發(fā)現(xiàn)影響胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵基因。新基因的確定對于探討胃癌發(fā)病機(jī)制、尋找腫瘤標(biāo)志物和生物治療靶點意義重大。EZH2即是受到關(guān)注的基因之一。研究顯示，EZH2蛋白具有癌基因特征，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，EZH2基因可促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、血管生成，與膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌等腫瘤進(jìn)展有關(guān)[3，6-7]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中EZH2蛋白表達(dá)比癌旁正常組織增強(qiáng)，提示EZH2具有原癌基因特征，可能促進(jìn)胃癌腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白陽性者腫瘤分化程度更差、臨床分期更晚，這也說明EZH2蛋白可能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展，但其促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制還需進(jìn)一步分析。

凋亡抵抗能力是多種惡性腫瘤具有的特性，這種特性導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞更易于生存而導(dǎo)致腫瘤存活并進(jìn)展[8]。凋亡抵抗是多種促凋亡基因和凋亡抑制基因共同作用的結(jié)果，Caspase-3和Bcl-2/Bax在其中發(fā)揮了重要作用。Caspase-3是凋亡的直接執(zhí)行者，該基因的活化可使受多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性增高，導(dǎo)致核小體間DNA裂解，引起細(xì)胞凋亡[9-10]；Bcl-2是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)節(jié)成員，可通過抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等多個途徑抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[11-12]。Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，可與Bcl-2形成二聚體，該二聚體的比值決定細(xì)胞的存活或凋亡[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁正常組織，而Caspase-3、Bax表達(dá)則明顯降低；Bcl-2蛋白表達(dá)均隨腫瘤病理分化程度降低、臨床分期進(jìn)展而增強(qiáng)，Caspase-3、Bax表達(dá)則隨腫瘤病理分化程度降低、臨床分期進(jìn)展而減弱。這些結(jié)果與文獻(xiàn)[14-15]報道相符。提示Caspase-3、Bcl-2、Bax可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡而參與了胃癌的進(jìn)展。Bcl-2與Bax表達(dá)呈負(fù)相關(guān)也證實了這一結(jié)論，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

已有研究證實，EZH2蛋白與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)[16]，但EZH2蛋白是否參與胃癌細(xì)胞凋亡及具體調(diào)控的報道尚不多見。因此本研究又分析了胃癌組織中EZH2與Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EZH2與Caspase-3蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示胃癌細(xì)胞中EZH2可能通過參與死亡受體途徑抑制Caspase-3表達(dá)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗。但具體機(jī)制尚需要更大規(guī)模的臨床實驗和體內(nèi)、體外基礎(chǔ)研究予以證實。

總之，本研究初步證實了EZH2、Bcl-2在胃癌組織中均存在表達(dá)增強(qiáng)，Caspase-3、Bax則出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，EZH2可能通過抑制Caspase-3表達(dá)而促進(jìn)胃癌進(jìn)展。但本研究還處于初級階段，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行基因干預(yù)等研究明確胃癌中EZH2與Caspase-3、Bcl-2、Bax的具體關(guān)系，這對闡明胃癌發(fā)病機(jī)制有重要意義。

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Relationship and significance of expression of EZH2 and Caspase-3, Bcl-2, Bax in gastric cancer

Gao Dequan1, Zhang Jianbo1, Wang Lianlin2, Cui Lijun3

(1.The People’s Hospital of Pingshan County, Pingshan 050400, Hebei, China; 2.Beiye Center Hospital of Pingshan County, Pingshan 050403, Hebei, China; 3.Xiaojiao Center Hospital of Pingshan County, Pingshan 050400, Hebei, China)

Objective It is to investigate the relationship and clinical significance between the expression of EZH2, Caspase-3, Bcl-2, Bax in gastric cancer. Methods The expressions of EZH2, Caspase-3, Bcl-2 and Bax were tested by immunohistochemically in 62 tumor tissue specimens of gastric cancer and 52 cases of tumor-adjacent tissues. The relationship and significance of these proteins were analyzed. Results Positive rates of EZH2, Bcl-2 in tumor tissues were higher than those in tumor-adjacent tissues, and expressions of Caspase-3, Bax were lower in tumor tissues than in tumor-adjacent tissues (allP<0.05) . The expression of EZH2 was positively related to degree of differentiation and TNM stages (allP<0.05). The expression of EZH2 was negatively correlated to Caspase-3, Bcl-2 and Bax (bothP<0.05). Conclusion EZH2 is over expressed in gastric cancer, and expression of EZH2 is related to differentiation and TNM stages. EZH2 may promote ability of apoptosis resistance of tumor cells by regulating expressions of Caspase-3.

gastric cancer; enhancer of zeste homolog 2; apoptosis related proteins

高德全，男，主治醫(yī)師，主要從事胃腸惡性腫瘤及急腹癥的臨床研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.007

R735.2

A

1008-8849(2014)15-1615-03

2013-10-20