秦文韜，黃曉慶，孔繁芳，王忠躍，張 昊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

葡萄霜霉病菌PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

秦文韜，黃曉慶，孔繁芳，王忠躍*，張 昊*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

通過對已測序和已報道的葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(BerketCurtis) Ber.etde Toni]細(xì)胞色素c氧化酶亞型2(cytochrome c oxidase Ⅱ，cox2)的基因序列進(jìn)行同源性比對分析，設(shè)計合成了一對用于P.viticola的檢測引物F-Pv/R-Pv。利用該引物對包括P.viticola在內(nèi)的30種常見植物病原真菌(包括15種Plasmopara屬真菌、8種葡萄常見致病菌)的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，驗證引物F-Pv/R-Pv的特異性，結(jié)果表明：該引物特異性強(qiáng)，僅P.viticola基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)一條600bp左右的特異性條帶，其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶；靈敏度驗證結(jié)果表明，該檢測法可以檢測出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因組DNA；應(yīng)用該方法對來自全國不同葡萄產(chǎn)區(qū)的不同品種的78份葡萄霜霉病菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，該檢測法適用范圍廣，且檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%。

葡萄霜霉病菌；cox2； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 檢測

葡萄霜霉病是世界和我國葡萄的第一大病害，發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，成為優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)的重要限制因素，一般年份可減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)70%～80%，并嚴(yán)重影響第二年產(chǎn)量，是現(xiàn)階段制約世界和我國葡萄產(chǎn)業(yè)的一大瓶頸[1]。葡萄霜霉病菌屬鞭毛菌亞門，卵菌綱，霜霉目、霜霉科、單軸霉屬的一種專性寄生真菌，該病菌主要侵染植株的幼嫩器官，如嫩葉、嫩梢和幼果。如果防治不及時，霜霉病會導(dǎo)致葡萄植株葉片脫落，枝梢扭曲，對葡萄樹勢、產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大的影響。該病在春夏季多雨潮濕的地區(qū)，如歐洲、日本、新西蘭、南非、阿根廷、澳大利亞東部以及我國的大部分地區(qū)均有發(fā)生[2]。

真菌的某些基因序列，如ITS序列，β-tublin(TUB) 基因，cox2基因等，在種內(nèi)不同菌株間具有高度的保守性，又在屬間和屬內(nèi)不同種間存在著豐富的多態(tài)性，利用這一特性對該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列分析后再設(shè)計特異性引物來進(jìn)行植物病原真菌的分子檢測是目前被廣泛接受的一種技術(shù)，PCR技術(shù)憑借其快速、準(zhǔn)確、重演性好的優(yōu)點已經(jīng)成為植物病原檢測的核心技術(shù)，得到越來越廣泛的應(yīng)用[3-5]。

本研究旨在建立葡萄霜霉病菌PCR檢測技術(shù)，以期為葡萄霜霉病的綜合防控提供新的思路，推動葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的葡萄霜霉病菌B1～B6待檢的78份葡萄霜霉病樣品(表1)分別采自全國不同葡萄種植區(qū)(全國15個省，2個直轄市，3個自治區(qū))和不同葡萄品種，引物特異性驗證試驗中供試的24種參照菌株來源見表2。

表1田間樣品的來源

Table1Sourcesofthesamplesinthefield

菌株編號Strainnumber菌株來源Source葡萄品種Variety菌株編號Strainnumber菌株來源Source葡萄品種Variety菌株編號Strainnumber菌株來源Source葡萄品種Variety菌株編號Strainnumber菌株來源Source葡萄品種Variety1河北石家莊巨峰21甘肅蘭州紅地球41北京通州黃意大利61黑龍江哈爾濱京秀2廣西南寧巨峰22河南鄭州紅地球42北京通州紅寶石無核62河北石家莊藤稔3山西太谷巨峰23河北保定紅地球43北京通州巨玫瑰63河北秦皇島赤霞珠4河北秦皇島巨峰24寧夏銀川紅地球44北京通州香妃64河北張家口西拉5湖南洪江巨峰25江蘇南京紅地球45北京通州無核白雞心65河北廊坊秋黑6湖北武漢巨峰26安徽合肥紅地球46北京通州甲斐乙女66河北廊坊黃意大利7四川成都彭鎮(zhèn)巨峰27天津武清紅地球47北京通州奧迪亞67河北廊坊莫麗莎8河北保定巨峰28山西太谷紅地球48北京通州維多利亞68河北廊坊夏黑9甘肅蘭州巨峰29四川成都彭鎮(zhèn)紅地球49北京通州京早晶69山東濟(jì)南貴妃玫瑰10河南鄭州巨峰30河北廊坊紅地球50北京通州魏可70山東青島紫脆無核11四川成都永安鎮(zhèn)巨峰31河北保定紅地球51北京通州無核早紅71北京大興玫瑰香12北京通州巨峰32四川成都永安鎮(zhèn)紅地球52湖南岳陽寶石72天津武清維多利亞13安徽合肥巨峰33北京大興紅地球53湖南岳陽紅寶石73廣西羅城毛葡萄14福建福州巨峰34遼寧大連紅地球54湖南岳陽夏黑74廣西金州毛葡萄15河北廊坊巨峰35新疆石河子紅地球55湖南懷化刺葡萄75寧夏銀川霞多麗16云南大理紅地球36北京通州紅地球56湖南洪江夏黑76浙江磬安藤稔17河北石家莊紅地球37北京通州美人指57湖北武漢夏黑77浙江余姚藤稔18河北秦皇島紅地球38北京通州貴妃玫瑰58黑龍江哈爾濱紅香水78福建福州京亞19遼寧熊岳紅地球39北京通州奧古斯特59黑龍江哈爾濱無核白雞心20湖北武漢紅地球40北京通州里扎馬特60黑龍江哈爾濱山葡萄

表2引物F-Pv/R-Pv特異性驗證所用菌株及其PCR檢測結(jié)果

Table2StrainsusedforspecificityvalidationofF-Pv/R-PvandtheirresultsofPCRamplification

菌株編號Number拉丁學(xué)名Latinname寄主(品種)Host(Variety)菌株來源SourcePCR結(jié)果PCRresult菌株編號Number拉丁學(xué)名Latinname寄主(品種)Host(Variety)菌株來源SourcePCR結(jié)果PCRresultB1Plasmoparaviticola葡萄(巨峰)中國吉林+B4P．viticola葡萄(魏可)中國遼寧+B2P．viticola葡萄(藤稔)中國山東+B5P．viticola葡萄(秋黑)中國湖北+B3P．viticola葡萄(京亞)中國河北+B6P．viticola葡萄(夏黑)中國廣西+1Plasmoparasp．地錦(未知)德國法蘭克福-13Phytophthorainfestans馬鈴薯本實驗室保存-2Plasmoparasp．地錦(未知)德國法蘭克福-14Ph．boehmeriae棉花本實驗室保存-3P．halstedii向日葵法國馬澤維爾-15Pythiumsp．蘆筍本實驗室保存-4Plasmoparasp．向日葵(703)德國法蘭克福-16Peronosporafarinosa未知本實驗室保存-5P．halstedii向日葵(701)法國馬澤維爾-17Guignardiabidwellii葡萄本實驗室保存-6P．halstedii向日葵(未知)法國馬澤維爾-18Conielladiplodiella葡萄本實驗室保存-7P．obducen鳳仙花南斯拉夫-19Botryotiniafuckeliana葡萄本實驗室保存-8P．muraris地錦德國法蘭克福-20Botryosphaeriarhodina葡萄本實驗室保存-9P．a(chǎn)ngustiterminalis蒼耳本實驗室保存-21B．dothidea葡萄本實驗室保存-10Albugoportulacae莧菜本實驗室保存-22Uncinulanecator葡萄本實驗室保存-11Phytophthoraparasitica煙草本實驗室保存-23Colletotrichumgloeosporioides葡萄本實驗室保存-12Ph．capsici辣椒本實驗室保存-24Pestalotiamangiferae葡萄本實驗室保存-

1.2 葡萄霜霉病菌基因組DNA的提取及cox2基因擴(kuò)增、測序

參考Xin等[6]報道的植物組織基因組DNA快速提取方法，略有改動。具體步驟如下：用已滅菌的牙簽或槍頭刮取少量霉層置于0.5 mL PCR管中，加入50μL Buffer A溶液(100mmol/L NaOH，2%Tween?20，Buffer A用10mol/L NaOH和20%Tween?20現(xiàn)配現(xiàn)用)，95 ℃溫育10min；然后加入50μL Buffer B溶液(100mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA)，振蕩混勻，12 000r/min離心15 s，得到含有葡萄霜霉病菌基因組DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系(20μL)：DNA模板1μL，10μmol/L的引物各1μL，20%PVP(W/V) 1μL，2% BSA(W/V) 1μL，2×PCR Mix 10μL，無菌水5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，50℃退火30s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，產(chǎn)物用AxyPrep PCR清潔試劑盒純化，經(jīng)pGM-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選陽性菌落，最后將篩選到的含有正確插入片段的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 特異性引物的設(shè)計

本研究根據(jù)已測序的結(jié)果、GenBank中已報道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列(DQ365760.1、EF426553.1、HM628744.1、HM628749.1等)，同時與已報道的Plasmoparaangustiterminalis(EU743812.1)、P.halstedii(EU743813)、P.penniseti(EF426475)、Peronosporaaparines(DQ365717)、Phytophthoracapsici(GU221961.1)、Pythiumadhaerens(HQ680578.1)等多種霜霉目真菌、常見的葡萄致病菌的cox2基因序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性的PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 引物特異性驗證

分別以6種靶標(biāo)菌株DNA和24種參照菌株DNA為模板，用特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同1.2，設(shè)置水為模板的陰性對照，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。

1.5 引物靈敏度驗證

用核酸濃度測定儀(Gene公司，NanoVue Plus)測定所提取的P.viticola基因組DNA濃度，并采用濃度梯度稀釋法將其稀釋到1～10-6ng/μL，然后利用特異性引物F-Pv/R-Pv，按1.2的反應(yīng)體系和程序分別對梯度稀釋的P.viticola基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。

1.6 田間葡萄葉片組織中霜霉菌的檢測

按1.2所述的方法分別提取待檢樣品的DNA，并分別以所提取的待檢樣品的DNA、健康葡萄葉片DNA、水為模板，用特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同1.2，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物設(shè)計

將測序獲得的P.viticola菌株cox2基因序列與GenBank中其他菌株的cox2基因序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)序列之間的同源性和差異性，設(shè)計了P.viticola的特異性引物F-Pv/R-Pv(表3)，目的片段大小約為600bp。

表3葡萄霜霉病菌cox2基因PCR擴(kuò)增引物序列
Table3Primersequencesofcox2gene

引物名稱Primer引物序列Sequence(5′?3′)F?PvCAAGATCCAGCAACTCCAGTTATGGAR?PvACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT

2.2 引物特異性驗證

以所提取的30種菌株DNA為模板(表1)，用所設(shè)計的特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果顯示：僅模板為P.viticola基因組DNA時，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)出一條600bp左右的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，而對其他24種參照菌株和陰性對照均為陰性，無任何條帶，其中有16種為霜霉目真菌(包括9種Plasmopara屬真菌)，另外8種為其他目的常見葡萄致病菌(圖1)。特異性檢測結(jié)果表明，所設(shè)計的引物具有種間的相對特異性，能夠區(qū)別P.viticola與其他Plasmopara屬的病原真菌，同時，具有屬間相對特異性，能夠區(qū)別其與霜霉目的其他部分真菌及其他葡萄上常見的病原菌。

圖1 引物F-Pv/ R-Pv特異性驗證結(jié)果Fig.1 Specificity validation of F-Pv/ R-Pv

2.3 引物靈敏度驗證

用特異性引物F-Pv/R-Pv分別對不同濃度梯度的P.viticola基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置無菌水為模板的陰性對照，結(jié)果顯示：隨著模板濃度的降低，瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度逐漸變暗，模板濃度為3.3pg/μL的葡萄霜霉病菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還能分辨出一條約600bp的特異性條帶(圖2)，而模板濃度小于3.3pg/μL以及無菌水對照均無明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，說明PCR法的靈敏度為3.3pg/μL。

2.4 發(fā)病葉片組織中葡萄霜霉病菌的檢測

用特異性引物F-Pv/R-Pv對來自于全國不同葡萄生態(tài)區(qū)域的78份葡萄霜霉病樣品DNA、健康葡萄葉片DNA、水分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果顯示，各地區(qū)的78份樣品均呈陽性，均出現(xiàn)了預(yù)期的目標(biāo)條帶，條帶的亮度因模板濃度的不同有所差異，而健康葡萄葉片DNA和水作模板的陰性對照未出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖3)，檢測準(zhǔn)確率為100%，說明引物F-Pv/R-Pv能特異性地檢測到發(fā)病葉片組織中的P.viticola基因組DNA的存在。

圖2 引物F-Pv/ R-Pv靈敏度驗證結(jié)果Fig.2 Sensitivity validation of F-Pv/ R-Pv

圖3 田間霜霉菌cox2基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR products of cox2 of Plasmopara viticola collected from fields

3 討論

葡萄霜霉病菌屬于專性寄生菌，很難進(jìn)行常規(guī)的分離培養(yǎng)，關(guān)于P.viticolaPCR檢測方面的相關(guān)報道較少，然而，PCR檢測技術(shù)在霜霉目真菌中的應(yīng)用已很廣泛，如Ioos等[7]建立的P.halstediiPCR檢測體系，能特異性地檢測出P.halstedii，靈敏度為3pg；Tooley等[8]建立的PhytophthoraPCR檢測體系，三種大小不同的PCR產(chǎn)物可以用于檢測馬鈴薯葉片和塊莖內(nèi)三種不同的致病菌，檢測靈敏度為1～10pg，為種薯和貯藏馬鈴薯內(nèi)P.infestans的檢測提供了有力工具；劉春來等[9]建立的大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)PCR檢測方法可以檢測出接種于土壤中的0.3個大豆疫霉菌游動孢子和0.06個卵孢子，對染病組織的檢測也表現(xiàn)出了較高的靈敏度，這都為本研究葡萄霜霉病菌PCR檢測法的建立提供了借鑒。

本研究通過對已測序和已報道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列進(jìn)行同源性比對分析，設(shè)計合成了一對用于P.viticola檢測的引物F-Pv/R-Pv。利用該引物對包括P.viticola在內(nèi)的30種常見植物病原真菌(包括15種Plasmopara屬真菌、8種葡萄常見致病菌)的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，驗證引物F-Pv/R-Pv的特異性，結(jié)果表明：該引物特異性強(qiáng)，僅P.viticola基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)一條600bp左右的特異性條帶，其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶；靈敏度驗證結(jié)果表明，該檢測法可以檢測出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因組DNA；應(yīng)用該方法對來自全國不同葡萄產(chǎn)區(qū)不同品種的78份葡萄霜霉病菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，該檢測法適用范圍廣，且檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%。

[1] 王忠躍.中國葡萄病蟲害與綜合防控技術(shù)[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2009.

[2] 李海強(qiáng).石河子地區(qū)葡萄霜霉病的發(fā)生規(guī)律及防治研究[D].新疆: 石河子大學(xué),2009.

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EstablishmentandapplicationofPCRfordetectionofPlasmoparaviticola

Qin Wentao, Huang Xiaoqing, Kong Fanfang, Wang Zhongyue, Zhang Hao

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

This study designed a pair of primers F-Pv/R-Pv forPlasmoparaviticoladetection based on the differences among sequenced and reportedcox2 gene sequences ofP.viticola.Totally 30kinds of plant pathogens,including 15 kinds of fungi belonging toPlasmoparaand 8 kinds of grape pathogens,were screened to validate the primers F-Pv/R-Pv.The results showed that the primers F-Pv/R-Pv were of high specificity,and only a single product of about 600bp was amplified fromP.viticolagenomic DNA.The sensitivity of the detection was 3.3pg/μL genomic DNA per 20μL PCR reaction volume.Genomic DNAs of 78 samples from different grape plantation areas in China were specifically detected by PCR assay with F-Pv/R-Pv,suggesting that this method was applicable to a wide scope with 100% detection accuracy rate.

Plasmoparaviticola;cox2; PCR; detection

2013-04-12

：2013-05-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203035)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項基金(nycytx-30)

S 436.631

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.019

致謝：Aleksandra Bulajic、Renaud IOOS、Tim Schubert、Otmar Spring等教授為本研究提供了寶貴的參照菌株DNA，國家葡萄產(chǎn)業(yè)

技術(shù)體系許多綜合試驗站為本研究提供了葡萄霜霉病樣品，在此一并表示感謝！

* 通信作者 Tel：010-62815926，E-mail: wangzhy0301@sina.com； Tel：010-62815613，E-mail: hzhang@ippcaas.cn