王 彥，曹志敏，張志肖，蘇秋竹，范保杰，劉長友，田 靜

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種重點實驗室，石家莊 050035)

綠豆立枯絲核菌研究初報

王 彥，曹志敏，張志肖，蘇秋竹，范保杰，劉長友，田 靜*

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種重點實驗室，石家莊 050035)

本研究通過形態(tài)學(xué)、菌絲融合群和致病力測定研究，對從河北省石家莊地區(qū)綠豆種植區(qū)分離的90個立枯絲核菌進行鑒定。在90個分離物中有71個屬于AG4，占供試分離物的78.89%，2個屬于AG2-2，占供試分離物的2.22%，另外17個分離物與標(biāo)準菌株不融合，占供試分離物的18.89%；屬于AG4的71個分離物中，55個與AG4完全融合(占77.46%)，16個與AG4不完全融合(占22.54%)。在溫室條件下采用人工接菌法對40個代表性分離物的致病力進行測定，發(fā)現(xiàn)不同分離物對同一品種的致病力存在差異，其中分離物R3、R6、R9、R35致病力最強，分離物R23、R31-1致病力最弱。屬于AG-4的分離物R3、R6、R9、R35與其他供試分離物致病力差異極顯著；屬于未知群體的分離物R20、R29和R24之間致病力差異極顯著；屬于AG2-2的分離物R21、R31-1致病力較弱，且差異不顯著。

綠豆； 立枯絲核菌； 菌絲融合群； 致病力

綠豆是豇豆屬中的一個栽培種，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]，近年來，國內(nèi)外需求量逐年上升，綠豆種植面積也逐年擴大[2]。由于綠豆的連年種植，綠豆病害發(fā)生也隨之加重，導(dǎo)致綠豆產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重下降。在綠豆病害中，由絲核菌引起的苗期立枯病是最重要的病害之一。立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)是一種在自然界中廣泛存在的土傳植物病原真菌，世界各地的耕作和非耕作土壤均有分布，且寄主范圍極廣。立枯絲核菌屬于多核絲核菌，主要引起植物的爛種、根腐、苗期猝倒和立枯病，導(dǎo)致作物缺苗斷垅，被認為是最具破壞力的土傳植物病原物之一[3]。本文從形態(tài)鑒定、核相測定、菌絲融合群判定和致病力測定等方面對從石家莊地區(qū)分離的綠豆立枯病菌分離物進行研究，旨在明確引起該地區(qū)綠豆立枯病的病原菌種內(nèi)分化情況，為綠豆抗病育種及病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 立枯絲核菌融合群標(biāo)準菌株

立枯絲核菌融合群標(biāo)準菌株AG-4、AG2-1、AG2-2、AG-5、AG1-IC和AG1-2B由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室惠贈。

1.2 綠豆立枯病病原菌分離

采用組織分離法[4]對所采集的123株綠豆病樣進行病原菌分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定為絲核菌的分離物在PDA培養(yǎng)基25 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后，挑取單枝菌絲尖端于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得單細胞培養(yǎng)物的純分離物。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定及核相測定

取0.6cm待測分離物菌餅接于涂有2%瓊脂層的載玻片中央，將接菌的載玻片置于保濕的培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)24～36h，取出，加蓋玻片，滴上番紅O-KOH染液，鏡檢。

取0.6cm待測菌餅接于水瓊脂培養(yǎng)基平板上，每菌兩皿，在菌塊周圍成45°斜插入4個蓋玻片，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長至蓋玻片1/2時，取出蓋玻片，滴上番紅O-KOH(0.5%的番紅6mL，3%的KOH 6mL，甘油3mL和蒸餾水85 mL)染液[5]，鏡檢各分離物細胞核數(shù)目。

1.4 菌絲融合群判別

參照Parmeter等[6]及陳延熙等改進的玻片配對法[7]，將待測絲核菌分離物分別與各標(biāo)準菌株配對培養(yǎng)，待兩菌落前緣交疊約0.5 cm后，取出載玻片，在兩菌落交疊處滴加0.001%苯胺蘭的稀釋乳酚油溶液，加蓋玻片，鏡檢[8-9]，按下列鑒定標(biāo)準判別分離物與標(biāo)準菌株的融合類型。完全融合：接觸細胞間的細胞壁溶解，原生質(zhì)融合，并有互誘現(xiàn)象。不完全融合或接觸融合：菌絲接觸后，細胞壁溶解，一細胞內(nèi)細胞質(zhì)流入另一細胞內(nèi)，且有殺死反應(yīng)。不融合：有或無引誘現(xiàn)象，菌絲接觸后，細胞壁不溶解，菌絲自由生長，互不干擾。

1.5 致病力測定

(1)接種方法

取1/4皿菌與700g滅菌土(121℃間歇滅菌2 h)充分混勻后，裝入花盆(直徑15 cm，高13cm)中，將長至2片三出復(fù)葉的幼苗(品種：‘冀綠7號’)移入花盆中，以不接菌滅菌土為空白對照。每處理12棵苗，3次重復(fù)，隨機排列，定期加水調(diào)節(jié)土壤濕度，25 ℃恒溫培養(yǎng)(12 h光照，12 h黑暗)，接菌7 d后，根據(jù)病情分級標(biāo)準，調(diào)查發(fā)病情況[10]。

(2)調(diào)查標(biāo)準

綠豆立枯病病情分級標(biāo)準參照Lipps[11]0～5級分級標(biāo)準：0級無病(無癥狀)；1級為莖稈上有褐斑，不足莖周1/2；2級為病斑達莖周的1/2；3級為病斑達莖周的1/2～3/4；4級為病斑超過莖周3/4，直至全株死亡。

按Lipps & Herr的方法[11]計算平均病情指數(shù)，即：

利用 DPS軟件對調(diào)查結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并采用 Duncan 新復(fù)極差檢驗對立枯絲核菌的致病力進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆立枯病病原菌分離

從采集的綠豆立枯病苗上分離到90個立枯絲核菌，占分離物的91%。其中30個分離自河北省鹿泉市，占33.33%，60個分離自河北省藁城市，占66.67%，其形態(tài)特征符合Parmeter[12]對立枯絲核菌的描述。

2.2 病原菌分離物形態(tài)學(xué)鑒定及核相測定

顯微鏡觀察結(jié)果表明，待測分離物的主要形態(tài)如下：菌絲近直角分枝、分枝處縊縮、細胞多核、有明顯隔膜、產(chǎn)生菌核，屬于立枯絲核菌(如圖1)。

圖1 綠豆立枯病病原菌菌絲形態(tài)Fig.1 Mycelia morphology of the pathogen causing mung bean seedling blight

核相測定結(jié)果表明，立枯絲核菌營養(yǎng)菌絲細胞為多核，細胞核數(shù)為3～16個，平均數(shù)為5個。

2.3 菌絲融合群鑒定

對經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為立枯絲核菌的90個分離物進行菌絲融合群鑒定(表1)，結(jié)果表明， 71個屬于AG4，占供試分離物的78.89%，2個屬于AG2-2，占供試分離物的2.22%，另有17個分離物與標(biāo)準菌株不融合，占供試分離物的18.89%，暫定為未知群體。屬于AG4的71個分離物中，55個 與AG4完全融合(占77.46%)，16個與AG4不完全融合(占22.54%)(圖2)。

表1供試分離物與標(biāo)準菌株的菌絲融合群判別結(jié)果1)

Table1ThehyphaefusionresultsoftestedRhizoctoniasolanistrainsandstandardstrains

菌株號No．ofstrain標(biāo)準菌株StandardstrainsAG?4AG2?1AG2?2AG?5AG1?ICAG1?2B菌株號No．ofstrain標(biāo)準菌株StandardstrainsAG?4AG2?1AG2?2AG?5AG1?ICAG1?2BR1?1+-----R1?2+-----R2?1+-----R2?2+-----R3?1+-----R4?1+-----R5?1+-----R5?2+-----R6?1+-----R7?1------R7?2------R8?1+-----R8?2+-----R8?3+-----R8?4+-----R9?1+-----R9?2+-----R10?1+-----R10?2+-----R11?1+-----R11?2+-----R11?3+-----R13?1+-----R14?1------R14?2+-----R14?3------R15?1------R15?2------R18?1+-----R22?1±-----R24?1+-----R24?2+-----R24?3+-----R25?1+-----R26?1+-----R27?1------R31?1--+---R31?2------R31?3------R31?4------R38?1------R38?2------R39?1+-----R40?1±-----R41?1+-----R42?1------R44?1±-----R45?1+-----R46?1+-----R47?1+-----R1+-----R3+-----R6+-----R7+-----R9+-----R10+-----R11+-----R12+-----R13+-----R14+-----R15+-----R16+-----R17+-----R18+-----R19+-----R20------R21--+---R22+-----R23+-----R24------R25+-----R26+-----R27+-----R28+-----R29------R30+-----R32------R33+-----R34+-----R35+-----R37+-----R38+-----R39+-----R40+-----R41+-----R45+-----R47+-----R48+-----R49+-----R50+-----

1)“+”為完全融合；“±”為不完全融合；“-”為不融合。 “+”: Complete fusion; “±”: Incomplete fusion of two mycelia; “-”: Non-fusion.

圖2 菌絲融合類型Fig.2 The type of hyphal fusion

2.4 病原菌菌株致病力測定

通過人工接菌方法對40個供試分離物進行致病力測定，結(jié)果表明，接菌7 d后，供試植株均表現(xiàn)典型的立枯病癥狀，對照無癥狀，但不同融合群之間和同一融合群不同分離物之間的致病力存在差異，其中分離物R3、R6、R9、R35致病力最強，分離物R23、R31-1致病力最弱。屬于AG-4的35個分離物中，分離物R3、R6、R9、R35與其他供試分離物致病力差異極顯著；屬于未知群體的3個分離物R20、R29和R24之間致病力差異極顯著；屬于AG2-2的2個分離物R21和R31-1致病力較弱，且差異不顯著[13](表2)。另外，研究發(fā)現(xiàn)AG2-2侵染植株后，植株莖稈褐斑不足莖周的1/2，并不致死苗[14]。

表2部分綠豆立枯絲核菌致病力測定

Table2VirulencetestofR.solanistrains

菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%Levelofsignificance菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%LevelofsignificanceR3100．0000aAR6100．0000aAR9100．0000aAR35100．0000aAR4897．9167aABR4997．9167aABR3897．2233aABR1495．8333abABCR2893．7500abcABCDR1990．9733bcdBCDER3290．2800bcdBCDER4788．8900cdeCDEFR4086．8067defDEFR2786．1100defDEFGR4185．4167defDEFGR1683．3333efgEFGR2081．2500fgFGHR2278．4733ghGHR2675．0000hHIR1568．7500iIJR3068．7500iIJR2566．6667iJKR3466．6667iJKR164．5833ijJKL

續(xù)表2Table2(Continued)

菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%Levelofsignificance菌株號No．ofstrain平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Levelofsignificance1%極顯著水平1%LevelofsignificanceR3960．4167jkKLMR2959．7200jkKLMR1357．6400klLMR1752．7800lmMNR2448．6133mNR4516．6667nOR1015．2767nOR1215．2767nOR188．7500oOPR115．9667opPQR215．2767opPQR75．2767opPQR374．9967opPQR504．5833opPQR31?14．1700opPQR234．1700opPQCK0．0000pQ

3 討論

3.1 綠豆立枯絲核菌菌絲融合群研究

國內(nèi)學(xué)者已對多種作物上的立枯絲核菌融合群進行了研究[15-21]。2005年楊金紅等[22]對新疆地區(qū)6種豆科植物立枯絲核菌融合群類型的研究表明，該地區(qū)侵染豌豆、豇豆和花生的優(yōu)勢融合群是AG-2，蠶豆的是AG-4，鷹嘴豆的是AG-1，大豆的是AG-1和AG-2。2009年楊金紅[23]又對新疆地區(qū)11種豆科植物立枯絲核菌的融合群類型及營養(yǎng)親和群進行了研究，結(jié)果共測定出5個融合群，其中4個融合群下各有2個營養(yǎng)親和群，說明新疆豆科作物立枯絲核菌各主要菌絲融合群內(nèi)均有不同程度的分化。

本研究初步明確綠豆立枯絲核菌菌絲融合群組成有AG-4和AG-2-2，其中AG-4出現(xiàn)頻率最高，分布最廣，是石家莊綠豆立枯病菌的優(yōu)勢融合群，由此可見，綠豆立枯絲核菌也存在菌絲融合群的分化。

3.2 綠豆立枯絲核菌致病力分化研究

目前關(guān)于立枯絲核菌致病力等級沒有統(tǒng)一的劃分標(biāo)準。李寶棟等[24]關(guān)于棉花立枯菌對不同棉花品種的致病力測定研究中，按病情指數(shù)的高低將棉花品種劃分為高感(病情指數(shù)>75)、中感(75≥病情指數(shù)≥55)和輕感(病情指數(shù)<55)3級。參考棉花分類標(biāo)準，我們試將立枯絲核菌菌株按病情指數(shù)的高低劃分為強致病力(病情指數(shù)>75)、中等致病力(75≥病情指數(shù)≥55)和弱致病力(病情指數(shù)<55)3級，本文中屬于AG4和未知群體的分離物有強、中、弱之分，屬于AG2-2的2個分離物均為弱致病力菌株。由此可見，分離物所屬菌絲融合群與分離物的致病力強弱無相關(guān)性。

利用致病力測定方法對菌株進行鑒定較分子方法(AFLP等)直觀，且能直接反映病菌的致病力強弱及品種抗病性差異。通過致病力測定，確定各種植區(qū)的優(yōu)勢菌株，以篩選到適合不同種植區(qū)的抗病品種，進行品種的合理布局。

本文僅對采集自石家莊鹿泉市和藁城市的綠豆病苗進行了菌株的分離，并對分離到的菌株進行了菌絲融合群及致病力研究，為進一步明確河北省綠豆種植區(qū)立枯病病原菌的分布及其分化情況，需要從河北省各綠豆種植區(qū)采集病樣，擴大試驗樣本量，并進行致病力及分子生物學(xué)研究，為綠豆立枯病病原菌預(yù)警監(jiān)測體系提供技術(shù)支持，同時也為綠豆立枯病病原菌防治提供理論依據(jù)，以期減少綠豆立枯病對綠豆生產(chǎn)造成巨大危害。

[1] 王明海,徐寧,包淑英,等.綠豆的營養(yǎng)成分及藥用價值[J].農(nóng)業(yè)科技,2012(6): 341-342.

[2] 劉慧.我國綠豆生產(chǎn)現(xiàn)狀和發(fā)展前景[J].農(nóng)業(yè)展望,2012(6): 36-39.

[3] 劉力,葛起新.華東地區(qū)立枯絲核菌融合群鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1987,13(3): 227-233.

[4] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1997.

[5] 周而勛,楊媚.從植物病組織中分離絲核菌的快速、簡便技術(shù)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,19(1): 125-126.

[6] Parmeter J R,Sherwood R T,Platt W D.Anastomosis grouping among isolates ofThanatephoruscucumeris[J].Phytopathology,1969,59(1): 1270-1278.

[7] 陳延熙,張敦華,段霞渝,等.關(guān)于Rhizoctoniasolani菌絲融合分類和有性世代的研究[J].植物病理學(xué)報,1985,15(8): 139-143.

[8] 吳秋欣.親和性實驗與高等擔(dān)子菌的系統(tǒng)學(xué)[J].真菌學(xué)報,1992,11(4): 249-257.

[9] 喻大昭,楊小軍,楊立軍.湖北省小麥紋枯病病原菌菌絲融合群研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2000(3): 39-42.

[10]肖炎農(nóng),李建生,鄭用鏈,等.湖北省玉米紋枯病病原絲核菌的種類和致病性[J].菌物系統(tǒng),2002,21(3): 419-424.

[11]Lipps P E,Herr L J.Etiology ofRhizoctoniacerealisin sharp eyespot of wheat[J].Phytopathology，1982，72：1574-1577.

[12]Parmeter J R.Rhizoctoniasolani,biology and pathology[M].Berkeley: University of California Press,1970.

[13]肖勇,劉明偉,李剛,等.四川省水稻立枯絲核菌Rhizoctoniasolani的遺傳分化與致病力[J].中國水稻科學(xué),2008,22(1): 87-92.

[14]鄧振山,張寶成,孫志宏,等.新疆北疆棉田立枯絲核菌不同菌絲融合群致病力的研究[J].植物保護,2006,32(4),36-39.

[15]黃江華,楊媚,周而勛,等.廣州地區(qū)10種作物立枯絲核菌菌絲融合群測定[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2002,15(1): 14-18.

[16]伍恩宇,夏海波,于金鳳.茄科蔬菜立枯絲核菌的融合群鑒定[J].植物病理學(xué)報,2008,38(4): 429-432.

[17]李克梅,郭慶元,趙莉,等.新疆苜蓿立枯絲核菌菌絲融合群及其致病性研究[J].草業(yè)科學(xué),2009(5): 151-154.

[18]楊金紅,白麗艷,郭慶元,等.新疆奶花蕓豆立枯絲核菌菌絲融合群及其致病性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,43(4): 302-305.

[19]井巖,李曉妮,金鳳.中國北方棉花主產(chǎn)區(qū)立枯絲核菌的融合群鑒定[J].菌物學(xué)報,2012,31(4): 540-547.

[20]曹守峰.中國與中亞五國棉花生產(chǎn)與貿(mào)易競爭力比較分析[J].中國棉花,2011,38(5): 11-13.

[21]Kuramae E E,Buzeto A L,Ciampi M B,et al.Identification ofRhizoctoniasolaniAG-1-IB in lettuce,AG-4-HG-Ⅰin tomato and melon,and AG-4-HG-Ⅲ in broccoli and spinach,in Brazil[J].European Journal of Plant Pathology,2003,109: 391-395.

[22]楊金紅,郭慶元,季良.新疆6種豆科作物立枯絲核菌菌絲融合群研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,42(6): 382-385.

[23]楊金紅.11種豆科作物立枯絲核菌菌絲融合群及營養(yǎng)親和群研究[J].植物保護,2009,35(6): 83-86.

[24]李寶棟，朱穎初.棉立枯菌對不同棉花品種致病力的測定[J].植物保護,1985,11(6): 31-32.

PreliminaryidentificationofRhizoctoniasolanicausingmungbeanseedlingblight

Wang Yan，Cao Zhimin，Zhang Zhixiao，Su Qiuzhu，F(xiàn)an Baojie，Liu Changyou，Tian Jing

(InstituteofCerealandOilCrops,HebeiAcademyofAgriculturalandForestrySciences/LaboratoryofCropGeneticandBreedingofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China)

Ninety isolates ofRhizoctoniasolani,collected from the mung bean field in Shijiazhuang region were characterized by morphology,anastomosis group and pathogenicity test.The results showed that all isolates were multinucleate.Seventy-one isolates belonged to the AG4,accounting for 78.89% of the tested isolates,55 isolates were completely fused with AG4 (77.46%),16strains were incompletely fused with AG4 (22.54%).Two isolates belonged to the AG2-2,accounting for 2.22% There were 17 strains that could not fuse with any standard strains,accounting for 18.89%.Virulence test in greenhouse demonstrated that the isolates R3,R6,R9 and R35 were highly virulent,but isolates R23and R31-1were weakly virulent.There were extremely significant difference between the isolates R3,R6,R9,R35 and the others belonging to AG-4,also between the isolates R20,R29 and R24 belonging to unknown group.The isolates R21and R31-1belonging to AG2-2 were weakly virulent and had no significant difference in virulence.

mung bean;Rhizoctoniasolani; anastomosis group; pathogenicity

2013-07-04

：2013-12-03

國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-09);河北省科技支撐計劃課題(11220108D)

S 435.22

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.009

* 通信作者 Tel: 0311-87670655; E-mail: nkytianjing@163.com