田兆豐， 劉偉成， 張濤濤， 董 丹， 羅 晨

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

京郊番茄主要病毒病毒原鑒定

田兆豐， 劉偉成， 張濤濤， 董 丹， 羅 晨*

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

近年來(lái)，番茄病毒病，特別是番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)病在北京地區(qū)空前暴發(fā)，給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，使番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)顯著降低。2012-2013年在北京周邊7個(gè)區(qū)縣，采集疑似感染病毒的番茄植株樣品325份，分別針對(duì)TYLCV、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)3種病毒進(jìn)行了PCR或ELISA 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，目前在北京地區(qū)大棚或溫室內(nèi)發(fā)生的番茄病毒病以TYLCV為主；露地番茄病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象比較普遍，病毒檢出率100%， 其中TYLCV檢出率達(dá)到75%以上。在TYLCV侵染的樣品中，TYLCV和CMV復(fù)合侵染占20%左右，TYLCV和TMV復(fù)合侵染占15%左右。部分樣品檢測(cè)到TYLCV、 CMV 和TMV 3種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

番茄; 病毒病; 鑒定

番茄是重要的蔬菜作物，病毒病對(duì)番茄的危害一直都是番茄生產(chǎn)的重要制約因素。引起番茄病毒病的毒原有20多種，主要有煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)和馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)[1-2]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，由于氣候變暖和種植結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致煙粉虱傳播的雙生病毒在全球范圍內(nèi)大面積擴(kuò)展和蔓延。在我國(guó)，影響番茄生產(chǎn)的主要病毒也由煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒演變?yōu)橛蔁煼凼瓊鞑サ姆腰S化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)，并在近幾年來(lái)形成暴發(fā)性危害[3-6]。

番茄黃化曲葉病毒病在番茄生產(chǎn)中是一種毀滅性病害，由番茄黃化曲葉病毒引起。該病毒屬于雙生病毒科(Geminiviridae)，菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，在自然條件下只能由煙粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式傳播，又被稱(chēng)為粉虱傳雙生病毒，是一類(lèi)具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA病毒[7]。該病毒在番茄、木薯和煙草等重要經(jīng)濟(jì)作物上危害嚴(yán)重，在世界許多國(guó)家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。

番茄黃化曲葉病毒1991年在我國(guó)廣西南寧市郊已有零星發(fā)生[5]，之后由南至北逐步擴(kuò)展蔓延，危害日益嚴(yán)重，2005-2010年在全國(guó)多個(gè)省市發(fā)展蔓延并有逐年加重的趨勢(shì)[6，9-11]，其發(fā)生危害程度與煙粉虱的發(fā)生程度相關(guān)。番茄黃化曲葉病毒2009年在北京首次報(bào)道[12]，之后在北京周邊地區(qū)迅速蔓延開(kāi)來(lái)，并在2009-2010年造成嚴(yán)重危害[13-14]，給菜農(nóng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。本課題組在工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于保護(hù)地番茄，露地番茄病毒病的發(fā)生更為復(fù)雜，往往不只一種毒原，因此，于2012-2013年對(duì)北京周邊區(qū)縣的保護(hù)地和露地番茄栽培品種主要病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的調(diào)查，以期為病毒病的癥狀識(shí)別、毒原種類(lèi)的鑒定、病毒病的防治和育種工作提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 番茄樣品的采集

在2012年4月-2013年5月，分別于朝陽(yáng)、大興、順義、懷柔、延慶、房山、密云等7個(gè)郊區(qū)縣的長(zhǎng)子營(yíng)、魏善莊、榆垡、青云店、大孫各莊、長(zhǎng)哨營(yíng)、韓村河、蟹島、小豐營(yíng)、長(zhǎng)陽(yáng)、不老屯等地采集番茄樣品共計(jì)325份，樣品采集后當(dāng)日或次日進(jìn)行檢測(cè)，或放于袋內(nèi)在4 ℃保存，并在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)TYLCV所用的陽(yáng)性對(duì)照和健康對(duì)照番茄品種均為‘佳粉18號(hào)’。 陽(yáng)性對(duì)照采自北京市房山區(qū)韓村河，健康對(duì)照番茄在試驗(yàn)溫室的養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)PCR檢測(cè)，確定陽(yáng)性樣品感染了TYLCV，健康樣品未感染TYLCV。

1.2 番茄黃化曲葉病毒的PCR檢測(cè)

1.2.1 番茄病葉總DNA的提取

采用天根公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒，每個(gè)樣品取植物新鮮組織約100 mg或干重組織約30 mg，加入液氮充分研磨后提取，具體操作方法按天根生化科技有限公司試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。最后將DNA洗脫在150 μL洗脫緩沖液(TE)中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測(cè)

按TYLCV基因組特異性保守序列設(shè)計(jì)PCR引物序列TYLCV-R：5′-CCA ATA AGG CGT AAG CGT GTA GAC-3′和TYLCV-F：5′-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3′,并由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，以提取的植物基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增體系為:模板<1 μL, TYLCV-R和TYLCV-F(10 μmol/L)各1 μL,2×Master Mix 12.5 μL,加ddH2O至終體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min;變性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 45 s、 延伸72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。從PCR產(chǎn)物中取5 μL，以1.0%瓊脂糖凝膠(含Gold View)電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，擴(kuò)增序列大小約為 543 bp。

1.3 煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒的血清學(xué)鑒定

TMV、CMV的ELISA檢測(cè)采用雙抗體夾心(DAS-ELISA)檢測(cè)法。具體步驟參照安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司ELISA試劑盒提供的步驟并稍作修改,使用酶聯(lián)檢測(cè)儀在405 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值A(chǔ)405。陰陽(yáng)性指標(biāo)： 樣品A405≥2倍健康樣品A405為陽(yáng)性，樣品A405<2倍健康樣品A405為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄樣品TYLCV病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1是部分番茄樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中生產(chǎn)上常見(jiàn)的感病品種‘仙客6號(hào)’的電泳條帶十分明顯，而生產(chǎn)上常用的抗病品種‘浙粉701’的條帶非常微弱。

圖1 部分番茄樣品的PCR檢測(cè)凝膠電泳結(jié)果Fig.1 PCR results for some tomato samples

不同地點(diǎn)番茄樣品的詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。在這次調(diào)查中，北京周邊的7個(gè)區(qū)縣均有TYLCV的發(fā)生，無(wú)論是抗病還是感病品種均檢測(cè)到TYLCV的侵染，但不同品種間癥狀有所區(qū)別，病毒檢出率也有差異。TYLCV在感病品種上的癥狀比較典型，如‘仙客6號(hào)’發(fā)病初期新生葉由葉緣開(kāi)始黃化，頂部葉片褪綠發(fā)黃、變小，隨后黃化區(qū)域向中脈擴(kuò)展，最后整個(gè)葉片枯黃，邊緣上卷，同時(shí)還伴隨植株矮化，開(kāi)花結(jié)果受阻；而多數(shù)抗病品種癥狀比較輕微，如‘浙粉701’，只是新葉呈現(xiàn)脈間失綠或花葉，與感病品種的癥狀差異較大，而與煙草花葉病毒引起的癥狀相似。

在不同地點(diǎn)采集的番茄感病品種‘仙客6號(hào)’、‘金棚1號(hào)’顯癥樣品的病毒檢出率均為100%，而抗病品種如‘浙粉701’、‘浙粉702’的癥狀不典型，有部分樣品未檢測(cè)到病毒?？傮w來(lái)看，在北京的大棚或溫室內(nèi)，番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生還是比較嚴(yán)重和普遍的。

表1 京郊地區(qū)保護(hù)地番茄TYLCV侵染的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1 PCR results of TYLCV on tomato plants in the greenhouse in Beijing suburbs

2.2 番茄樣品TYLCV、TMV、CMV復(fù)合侵染的檢測(cè)鑒定

露地番茄病毒病發(fā)病癥狀比較復(fù)雜，部分是由幾種病毒復(fù)合侵染造成。表2是對(duì)TYLCV、TMV、CMV 3種病毒復(fù)合侵染情況的檢測(cè)鑒定結(jié)果。

待測(cè)樣品采自露地番茄，其番茄病毒病的癥狀復(fù)雜、多樣，有些番茄的不同部位分別表現(xiàn)有蕨葉、花葉、黃化或壞死等癥狀?？傮w來(lái)看，感染TYLCV的癥狀主要表現(xiàn)為葉緣黃化合并卷曲;感染CMV主要表現(xiàn)為葉片蕨葉，而感染TMV主要表現(xiàn)為花葉、銹斑或壞死。由表2可見(jiàn)，TYLCV、CMV、TMV有2種甚至3種病毒復(fù)合侵染同一植株的現(xiàn)象，不同病毒特有的癥狀在同一植株上可以同時(shí)有所表現(xiàn)。如2、9號(hào)樣品組的植株同時(shí)表現(xiàn)了葉緣黃化和蕨葉，就是典型的TYLCV和CMV復(fù)合侵染后的癥狀，其樣品也同時(shí)檢測(cè)到了2種病毒的存在；檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)， 2、9號(hào)樣品組雖然都測(cè)出了TYLCV和CMV，但這2組樣品中TYLCV的PCR條帶十分微弱，證明其病毒含量較低，這應(yīng)當(dāng)是復(fù)合侵染中2種病毒在營(yíng)養(yǎng)和空間上相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果；15號(hào)樣品組也表現(xiàn)了TYLCV和CMV 2種病毒復(fù)合侵染的癥狀，但15號(hào)樣品組的個(gè)別樣品只檢測(cè)出了TYLCV，還有個(gè)別樣品只檢測(cè)出了CMV。

表2 京郊露地番茄TYLCV、TMV、CMV復(fù)合侵染的檢測(cè)鑒定結(jié)果1)Table 2 Testing results for TYLCV, TMV and CMV mixed infection on tomato plants in Beijing suburbs

1) “+”，表示樣品A405≥2倍健康樣品A405，為陽(yáng)性；“-”，表示樣品A405<2倍健康樣品A405，為陰性。
“+”indicated the positive results(whenA405for detected sample≥2×A405for healthy sample); “-”indicated the negative results(whenA405for detected sample <2×A405for healthy sample).

由檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，露地番茄樣品病毒病檢出率100%， 其中TYLCV檢出率達(dá)到75%以上。在TYLCV侵染的樣品中，TYLCV和CMV復(fù)合侵染占20%左右，TYLCV和TMV復(fù)合侵染占15%左右。部分樣品檢測(cè)到TYLCV、 CMV 和TMV 3種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

3 討論

過(guò)去幾十年中，我國(guó)發(fā)生的番茄病毒病以TMV、CMV、PVY、PVX為主[1-2]，自1991年番茄黃化曲葉病毒在廣西南寧發(fā)生以來(lái)[5]，逐步擴(kuò)展蔓延，至今已經(jīng)上升為番茄上最嚴(yán)重的病毒病害。在這次調(diào)查的7個(gè)區(qū)縣的溫室大棚中TYLCV的發(fā)生率在90%以上,發(fā)病率60%～100%，CMV、TMV發(fā)生率為20%～30%，發(fā)病率10%左右。

番茄病毒病的發(fā)生與氣候、栽培條件等因素密切相關(guān)。煙草花葉病毒主要由農(nóng)事操作接觸傳播，但種子和土壤均可帶毒傳播[15]，過(guò)去春季溫室里的番茄以感染煙草花葉病毒TMV為主；黃瓜花葉病毒主要由蚜蟲(chóng)以非持久方式傳播，也可機(jī)械傳播，病毒可在多年生宿根植物或雜草上越冬，然后傳播到番茄上[16]。溫度高、光照強(qiáng)、干旱的條件利于蚜蟲(chóng)的繁殖和遷飛，因此利于CMV傳播和擴(kuò)散[17]，所以，秋晚番茄以感染CMV為主。目前，煙粉虱已經(jīng)成為溫室常年發(fā)生并較難防治的主要害蟲(chóng)，所以，溫室內(nèi)由煙粉虱以持久方式傳播的TYLCV為常年發(fā)生的主要病毒病；在露地，由于傳毒的昆蟲(chóng)介體比較復(fù)雜，TYLCV、CMV、TMV 3種病毒的發(fā)生情況有所變化，CMV或TMV的發(fā)生率、發(fā)病率均顯著上升，而TYLCV的發(fā)生、發(fā)病率有所下降，而且有幾種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)近年來(lái)已經(jīng)開(kāi)始栽種抗番茄黃化曲葉病毒的抗、耐病品種‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘浙雜301’、‘中雜101’等[18-19]，但在發(fā)病嚴(yán)重的地塊仍可檢測(cè)到病毒的侵染，不過(guò)發(fā)病癥狀較輕，發(fā)病率和病情指數(shù)都較低，對(duì)番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)影響較??；感病品種‘金棚1號(hào)’、‘仙客6號(hào)’等發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率和病情指數(shù)都很高，目前栽培面積已經(jīng)減少；抗病品種‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘中雜101’等栽培面積的擴(kuò)大，對(duì)控制病情和阻止其蔓延起到了較好的效果。盡管如此，由于大棚、溫室的連作栽培使番茄種植茬口相接，導(dǎo)致徹底滅虱和清園工作存在一定困難，這也給病毒病的防治帶來(lái)一定的難度。

在露地番茄復(fù)合侵染現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)番茄植株同時(shí)被TYLCV、CMV或TMV侵染時(shí)，同一植株上可以同時(shí)出現(xiàn)不同種病毒的癥狀，這些癥狀不是混合出現(xiàn)而是在植株的不同部位分別出現(xiàn)，說(shuō)明復(fù)合侵染的這幾種不同病毒之間沒(méi)有交叉保護(hù)作用，但在同一植株內(nèi)仍然有空間競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象[20]。

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IdentificationofseveralmainvirusdiseaseoftomatoinBeijing

Tian Zhaofeng, Liu Weicheng, Zhang Taotao, Dong Dan, Luo Chen

(InstituteofPlant&EnvironmentProtection,BeijingAcademyofAgriculture&ForestrySciences,Beijing100097,China)

In recent years, tomato virus disease, especiallyTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) disease in Beijing area occurred seriously, and the yield and quality of tomato reduced significantly. During 2012-2013, suspected virus infection samples of tomato collected in seven districts around Beijing were detected by PCR or ELISA for TYLCV,Tobaccomosaicvirus(TMV) andCucumbermosaicvirus(CMV), respectively. The results showed that TYLCV disease was dominant in the greenhouse. In the open field, the mixed infection of several virus was common, with the total detection rate up to 100%, in which the positive rate for TYLCV was over 75%. In the TYLCV infected samples, the mixed infection for TYLCV and CMV accounted around 20%, and about 15% for TYLCV and TMV. Some samples were found to be infected by the three viruses simultaneously.

tomato; virus disease; identification

2013-12-24

：2014-03-22

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201003065)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B00)；北京市自然科學(xué)基金(6122017)

S 436.412.11

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.025

* 通信作者 E-mail:luochen1010@163.com