胡加誼， 羅志文， 李向宏， 范鴻雁, 周 朋，章紹延， 張治禮， 劉志昕， 何 凡*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹研究所/農(nóng)業(yè)部海口熱帶果樹科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， ?？?571100；2.海南省農(nóng)墾科學(xué)院， ?？?570206；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海口 571101)

菠蘿凋萎相關(guān)病毒-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用

胡加誼1,2， 羅志文1， 李向宏1， 范鴻雁1, 周 朋3，章紹延3， 張治禮1， 劉志昕3， 何 凡1*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹研究所/農(nóng)業(yè)部?？跓釒Ч麡淇茖W(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， ?？?571100；2.海南省農(nóng)墾科學(xué)院， ?？?570206；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海口 571101)

菠蘿凋萎相關(guān)病毒-1(Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-1, PMWaV-1)是田間檢出率最高的菠蘿凋萎病毒。本研究根據(jù)PMWaV-1 CP基因保守序列設(shè)計(jì)特異性TaqMan探針和引物，建立并優(yōu)化了PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。優(yōu)化后的反應(yīng)體系制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.307×logx+38.18，相關(guān)系數(shù)r2為0.998。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能特異性地檢測(cè)PMWaV-1，對(duì)PMWaV-2、3和陰性對(duì)照均無反應(yīng)；最低檢測(cè)限達(dá)到40拷貝。重復(fù)性試驗(yàn)表明批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1.98%，是一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性較好的PMWaV-1定量檢測(cè)方法。樣品檢測(cè)結(jié)果表明PMWaV-1在菠蘿植株老葉、嫩葉和吸芽中的病毒含量呈遞減趨勢(shì)。

菠蘿凋萎相關(guān)病毒-1; TaqMan探針; 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR; 檢測(cè)

菠蘿凋萎病(mealybug wilt of pineapple, MWP)是世界各菠蘿主產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一，對(duì)菠蘿生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[1-2]。海南、廣東、廣西等地均有MWP發(fā)生[3,8-10]，海南瓊海菠蘿園發(fā)病率高達(dá)60%以上， 經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)25%～30%[3-4]。MWP被認(rèn)為是菠蘿凋萎相關(guān)病毒-2(Pineapplemealybugwilt-associatedvirus-2)與菠蘿粉蚧共同危害所引起[5-6]。然而，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)在菠蘿種植區(qū)檢出率最高的菠蘿凋萎相關(guān)病毒是PMWaV-1[7-10]，受PMWaV-1侵染的菠蘿植株平均單果重下降，早熟果比率升高，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致田間損失高達(dá)30%[11-12]。病毒性病原引起的植物病害目前沒有防效顯著的藥劑可供選擇，為降低菠蘿凋萎病帶來的損失，選用無毒繁殖材料至關(guān)重要，而菠蘿凋萎相關(guān)病毒在寄主植株體內(nèi)含量普遍很低，所以為避免普通RT-PCR檢測(cè)靈敏度所限而呈現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象，提高種苗篩選質(zhì)量和篩選效率，急需建立一種快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的方法。由于PMWaV-2被認(rèn)為是引起MWP的直接病原，因此目前菠蘿凋萎病毒的檢測(cè)主要是針對(duì)PMWaV-2， PMWaV-1的檢測(cè)方法仍局限于組織免疫印跡[13-14]、免疫電鏡(ISEM)和RT-PCR[15]。但免疫學(xué)方法操作復(fù)雜，病毒較難提純而難以獲得單克隆抗體；普通RT-PCR對(duì)假陰性樣本的檢測(cè)靈敏度有限且核酸后處理需要接觸EB等有毒試劑，還容易引起交叉污染造成假陽性。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，越來越多地被用于植物病毒的定量檢測(cè)。

本研究根據(jù)PMWaV-1外殼蛋白(coat protein)基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過多次試驗(yàn)優(yōu)化了PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系，建立了基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，以期為菠蘿無毒繁殖材料的篩選提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

用于構(gòu)建PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的菠蘿植株樣品采自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹研究所科研基地；樣品檢測(cè)材料采自海南省澄邁縣福山鎮(zhèn)果園，包括‘巴厘種’、‘臺(tái)農(nóng)16號(hào)’、‘臺(tái)農(nóng)17號(hào)’3個(gè)菠蘿品種的老葉、嫩葉和吸芽共12個(gè)樣品。所有植物材料經(jīng)液氮處理，研磨成粉末狀，于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 試劑及儀器

RNA提取試劑盒為BioTeke公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和Trans5α Cell購自TransGen公司；pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2000、Real Master Mix(Prob)均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒均購自Axygen公司；TaKaRa TP600 PCR儀；Stratagene公司的Mx3005 熒光定量PCR儀；美國Thermo NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中PMWaV-1 CP基因(HE983617, EU769114, JN995532, JN995531)的保守序列，設(shè)計(jì)一條特異性探針和一對(duì)特異性引物，探針5′ 標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，3′ 標(biāo)記BHQ2淬滅基團(tuán)。引物和探針由上海生工生物工程公司合成。引物和探針序列見表1。

表1 PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和探針Table 1 Primers and probe designed for detection and quantification of PMWaV-1 by RT-qPCR

1.2.2 菠蘿葉片總RNA 提取與cDNA合成

稱取0.1 g的菠蘿葉片基部白色組織，按照BioTeke公司的多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)說明書提取總RNA。以提取的總RNA為模板，參照TransGen公司的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總RNA 5 μL、Anchored Oligo(dT)primer(0.5 μg/μL) 1 μL、Random Primer(0.1 μg/μL) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA-free Water 補(bǔ)足至20 μL。混合液置于42 ℃水浴1 h后，85 ℃孵育5 min結(jié)束反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.3.1RT-PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物回收

20 μL RT-PCR擴(kuò)增體系包含TranGenTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+) 2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 1 μL，PMWaV-1-F(10 μmol/L) 0.5 μL，PMWaV-1-R(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA1 μL和ddH2O 14.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 保溫。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并參照Axygen公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3.2連接轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取

按照TaKaRa公司pMD18-T載體說明書將回收片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h以上。提取質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、測(cè)序確定目標(biāo)序列。以核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定陽性質(zhì)粒濃度，按照公式C=A/B×6.02×1014[其中C為拷貝/μL，A為以A260分析得到的濃度(ng/μL)，B為質(zhì)粒DNA分子量]計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，按10倍梯度稀釋質(zhì)粒，-20 ℃保存，作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.2.4.1反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)

25 μL反應(yīng)體系中加入Premix ExTaq(probe qPCR)(2×) 12.5 μL，10 μmol/L PMWaV-1-F 和PMWaV-1-R各0.5 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.5 μL，10 μmol/L PMWaV-1-Probe 1 μL，模板1 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，循環(huán)40次。

1.2.4.2反應(yīng)體系優(yōu)化

以含目的片段的質(zhì)粒DNA為模板，在保證1.2.4.1反應(yīng)體系中其他條件一致下，逐項(xiàng)優(yōu)化引物濃度、探針濃度和Premix ExTaq濃度，各個(gè)優(yōu)化項(xiàng)目濃度梯度設(shè)置如表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系濃度優(yōu)化Table 2 Optimization of the concentrationfor RT-qPCR reaction system

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋含目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，取終濃度為4.05×103～4.05×108拷貝/μL的6個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒樣品為模板，按1.2.4.2中優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系在Mx3005熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得出不同濃度質(zhì)粒的熒光擴(kuò)增曲線，儀器軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

1.2.6.1特異性試驗(yàn)

選取帶有PMWaV-2、PMWaV-3的菠蘿葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA與帶有PMWaV-1 CP片段的重組質(zhì)粒在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.6.2靈敏度試驗(yàn)

以終濃度為4.05×100～4.05×108拷貝/μL共9個(gè)梯度濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按優(yōu)化的反應(yīng)體系在Mx3005熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得出熒光定量RT-PCR對(duì)PMWaV-1的最低檢測(cè)限，并與普通RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行比較。

1.2.6.3重復(fù)性試驗(yàn)

以終濃度為4.05×103～4.05×107拷貝/μL共5個(gè)稀釋濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，連續(xù)3 d即設(shè)置3次試驗(yàn)重復(fù)，根據(jù)試驗(yàn)所獲得的Ct值計(jì)算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.2.7 樣品檢測(cè)

以12個(gè)待測(cè)樣品的cDNA作為模板，按1.2.4.2中優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系在Mx3005熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得出不同樣品的熒光擴(kuò)增曲線，得到熒光擴(kuò)增曲線的Ct值，將Ct值帶入1.2.5所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各檢測(cè)樣品的病毒拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

以菠蘿總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增PMWaV-1 CP基因片段，結(jié)果顯示，引物對(duì)PMWaV-1-F和PMWaV-1-R能夠靈敏地?cái)U(kuò)增到一條清晰的、與預(yù)測(cè)片段大小一致的片段(圖1)，經(jīng)測(cè)序分析及BLAST比對(duì)，確定所獲得的序列為PMWaV-1 CP基因片段。

圖1 凝膠電泳分析RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR amplification analyzed by agarose gel electrophoresis

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量鑒定及拷貝數(shù)計(jì)算

根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280為1.87，說明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品純度較高；并根據(jù)公式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為4.05×108拷貝/μL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍稀釋為4.05×100～4.05×109拷貝/μL共9個(gè)梯度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

由圖2可以看出，PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系優(yōu)化的結(jié)果為，Premix ExTaq(2×)13 μL，10 μmol/L PMWaV-1-F和10 μmol/L PMWaV-1-R各200 nmol/L，PMWaV-1-Probe 400 nmol/L。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 Optimizing reaction mix of RT-qPCR

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)，RT-qPCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，根據(jù)終濃度為4.05×103～4.05×108拷貝/μL 6個(gè)梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.307 logx+38.18，擴(kuò)增效率為100.6%，質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)與Ct值線性相關(guān)系數(shù)r2為0.998。表明所建立的RT-qPCR方法滿足對(duì)PMWaV-1檢測(cè)試驗(yàn)的可信度要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品動(dòng)力曲線圖Fig.3 Standard curve of RT-qPCR for PMWaV-1

2.5 PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.5.1 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖4，除了含PMWaV-1目的片段的陽性質(zhì)粒出現(xiàn)很好的擴(kuò)增曲線外，PMWaV-2、PMWaV-3和陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果均無熒光吸收值的變化，表明本試驗(yàn)所建立的PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有很高的特異性。

圖4 PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-1

2.5.2 靈敏度試驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與普通RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度比較試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度比普通RT-PCR檢測(cè)方法高10倍。

圖5 PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR靈敏度(a)與普通RT-PCR檢測(cè)靈敏度(b)Fig.5 The sensibility of RT-qPCR(a)and general RT-PCR(b) for PMWaV-1

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法在同一批次試驗(yàn)中，各濃度梯度擴(kuò)增曲線Ct值的變異系數(shù)均小于0.23%，各梯度批間變異系數(shù)均小于1.98%，表明該方法具有良好的重復(fù)性，可用于PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量檢測(cè)。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility of RT-qPCR for PMWaV-1

2.6 樣品檢測(cè)

從海南省澄邁縣采集的12個(gè)菠蘿植株樣品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6)表明，該方法對(duì)12個(gè)樣品均能特異性地檢測(cè)到PMWaV-1，并且不同植株、相同植株不同生長(zhǎng)部位病毒含量均有一定差異，其中老葉病毒含量較高，嫩葉次之，吸芽病毒含量最少。

圖6 不同菠蘿植株不同生長(zhǎng)部位PMWaV-1拷貝數(shù)Fig.6 Copies in different tissues of pineapple plants infected by PMWaV-1

3 討論

目前通用的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)主要有兩類：一類是非特異的DNA嵌入染料(如SYBR Green I)；另一類是以雜交形式進(jìn)行的單鏈檢測(cè)系統(tǒng)，如水解探針(如TaqMan)、雜交探針(如LightCycler)等。非特異性染料是與雙鏈DNA相結(jié)合的染料，其優(yōu)點(diǎn)是能適用于任何一對(duì)引物，成本較低。但存在與非特異性擴(kuò)增片段和引物二聚體等結(jié)合產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象，影響試驗(yàn)的可信度。本試驗(yàn)所采用的是特異性染料，TaqMan水解探針，它能夠高特異性地結(jié)合目的片段，避免了非特異性染料較易出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象。同時(shí)，通過與GenBank上報(bào)道的PMWaV-1 CP基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PMWaV-1 CP基因的同源性高達(dá)99.16%，此外，本試驗(yàn)選取了CP基因上相對(duì)保守的序列設(shè)計(jì)高特異性的TaqMan探針，最大程度避免了因?yàn)椴煌《痉蛛x物序列差異導(dǎo)致探針無法結(jié)合到靶標(biāo)序列而造成的假陰性現(xiàn)象。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在方法學(xué)上分為兩類：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。其中絕對(duì)定量方法在植物RNA病毒的應(yīng)用中一般選取體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，但此類標(biāo)準(zhǔn)品較難制備和保存。所以，本試驗(yàn)是通過制備重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到對(duì)PMWaV-1的絕對(duì)定量。這樣就減少了體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備的步驟和消耗，重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品也更加利于保存。樣品檢測(cè)中，對(duì)各個(gè)樣品所提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度測(cè)定后，將RNA濃度稀釋到相同水平，在相同的反應(yīng)體系中同時(shí)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的模板，這樣就有效減小了因樣品RNA提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率引起的誤差。

在我國，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)目前已在柑橘衰退病毒[16]、香蕉苞片花葉病毒[17]、蘋果莖溝病毒[18]和甘蔗黃葉病毒[19]等多種果樹病毒檢測(cè)上得以應(yīng)用，體現(xiàn)出了高特異性、高靈敏度、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)。在本研究中，樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，海南菠蘿MWP具有顯著的假陰性現(xiàn)象，且普通RT-PCR檢測(cè)較不穩(wěn)定，不能客觀反映樣本的帶毒情況，而本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系可以檢測(cè)到低拷貝的病毒，靈敏度高，所得到的結(jié)果更加客觀、可信。

本試驗(yàn)建立的PMWaV-1實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)不僅可以為菠蘿種苗篩選及菠蘿組培苗培育過程中病毒含量的檢測(cè)和監(jiān)控提供技術(shù)支持，還可應(yīng)用于病毒在植株體內(nèi)運(yùn)動(dòng)復(fù)制規(guī)律及其與寄主互作機(jī)制的研究。

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Developmentandapplicationofreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRmethodforthedetectionofPineapplemealybugwiltassociatedvirus-1

Hu Jiayi1,2, Luo Zhiwen2, Li Xianghong1, Fan Hongyan1,Zhou Peng3, Zhang Shaoyan3, Zhang Zhili1, Liu Zhixin3, He Fan1

(1.InstituteofTropicalFruitTrees,HainanAcademyofAgriculturalScience/HaikouInvestigationStationofTropicalFruitTrees,MinistryofAgriculture,HainanHaikou571100; 2.AgriculturalReclamationAcademyofSciences,Haikou570206,China; 3.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,P.R.China,InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou571101)

Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-1(PMWaV-1) highly infected pineapple in growing region in Hainan Province. A method of real-time fluorescent quantitative RT-PCR was established and optimized by using TaqMan probe and specific primers according to conserved sequence from the coat protein(CP) gene of PMWaV-1. The standard curve of the method wasy=-3.307×logx+38.18,r2=0.998. The results showed that the method was specific to PMWaV-1 and minimum detectable copies were 40. Both the variation coefficient of intra-assay and inter-assay for the method were less than 1.98%. Therefore, the established real-time fluorescent quantitative RT-PCR is a sample, specific, sensitive and reproducible method for PMWaV-1 detection. Detection analysis indicated that the content of PMWaV-1 in old leaves, younger leaves and suckers went down gradually.

PMWaV-1; TaqMan probe; real-time fluorescent quantitative RT-PCR; detection

2014-01-03

：2014-05-16

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203021)；海南省重大科技項(xiàng)目(ZDZX2013020-3)；海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(瓊財(cái)預(yù)[2013] 131號(hào))；海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃應(yīng)用研究及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(ZDXM20130031)；海南省自然科學(xué)基金(瓊科[2013]32號(hào))

S 436.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.021

致謝：本試驗(yàn)主要在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的各位老師和同學(xué)提供的試驗(yàn)條件和試驗(yàn)操作的指導(dǎo)表示誠摯的謝意。

* 通信作者 E-mail：hefanhn@163.com