張亞平, 吳圣勇, 王海鴻, 雷仲仁

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

球孢白僵菌液體生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件優(yōu)化

張亞平, 吳圣勇, 王海鴻, 雷仲仁*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

以菌株液體發(fā)酵過(guò)程中菌絲干重和芽生孢子濃度為測(cè)試指標(biāo)，對(duì)球孢白僵菌DZDC-9菌株液體發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株生長(zhǎng)的適宜碳源為葡萄糖，適宜氮源為酵母粉，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加0.000 5 mol/L KCl可以顯著提高菌絲和芽生孢子濃度。通過(guò)單因素分析和正交設(shè)計(jì)對(duì)不同培養(yǎng)條件下菌絲生長(zhǎng)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度26 ℃，培養(yǎng)液裝樣量1/5，初始接菌量107個(gè)/mL，轉(zhuǎn)速200 r/min的培養(yǎng)條件下，菌株液體發(fā)酵能在60 h達(dá)到最大菌絲生長(zhǎng)量(13.184±0.328 6)g/L。利用篩選出的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行液固雙相發(fā)酵試驗(yàn)，得到的孢子粉產(chǎn)量為(22.30±1.78)g/kg大米，顯著高于優(yōu)化之前的產(chǎn)量(13.04±1.90)g/kg大米。

球孢白僵菌; 液體發(fā)酵; 營(yíng)養(yǎng)需求; 培養(yǎng)條件; 產(chǎn)孢量

近年來(lái)，隨著害蟲抗藥性的增加，生物防治逐漸成為人們的研究熱點(diǎn)，其中蟲生真菌受到人們的關(guān)注，而球孢白僵菌作為一種廣譜性的昆蟲病原真菌，可以用于控制多種有害生物[1]，并逐漸成為可以替代化學(xué)農(nóng)藥的商業(yè)化產(chǎn)品[2]。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，白僵菌不僅對(duì)環(huán)境安全，對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)害，還可以借助蟲體繁殖，引起再次侵染[3]。如何大量繁殖球孢白僵菌便成為菌株推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于白僵菌的生產(chǎn)進(jìn)行了多方面的研究，加拿大Goettel[4]使用淺盤、麥麩、玻璃紙和高壓尼龍袋的方法生產(chǎn)菌粉，玻璃紙作為一種半透膜，隔絕菌體和培養(yǎng)基，以此獲得純孢粉。胡加付[5]等利用低值農(nóng)副產(chǎn)品為載體，利用淺盤發(fā)酵法對(duì)固體發(fā)酵的條件和載體配比進(jìn)行了優(yōu)化，以此獲得了大量原孢粉。Rombach[6]利用液體深層培養(yǎng)的方式獲得液生分生孢子，Pham[7]等對(duì)液體深層培養(yǎng)產(chǎn)孢條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了液生分生孢子大量生產(chǎn)的優(yōu)化條件，周曉妹[8]也對(duì)白僵菌液體深層培養(yǎng)方式進(jìn)行了優(yōu)化，篩選了適合液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。無(wú)論是固體發(fā)酵還是液體發(fā)酵都存在一定缺陷，無(wú)法滿足擴(kuò)大生產(chǎn)高純白僵菌孢子粉的需求，目前研究應(yīng)用較多的是液固雙相發(fā)酵產(chǎn)孢，充分結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì)，首先利用液體發(fā)酵生產(chǎn)大量的菌絲體和芽生孢子，再通過(guò)固體載體接種培養(yǎng)、干燥和分離，最后得到大量分生孢子[9]。而菌絲體和芽生孢子對(duì)后期固體接種產(chǎn)量的提高有顯著性影響，如何快速獲得大量菌絲體和芽生孢子對(duì)于縮短發(fā)酵時(shí)間和提高發(fā)酵產(chǎn)量是非常重要的。目前研究較多的主要是固體接種材料及培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響[10-11]，液體發(fā)酵也主要以液體深層發(fā)酵獲得液生分生孢子或芽生孢子侵染體為目的進(jìn)行研究[12-13]，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，對(duì)于單純以獲得大量菌絲體和芽生孢子為目的，為后期固體接種提供發(fā)酵液的研究較少。

本試驗(yàn)選用經(jīng)過(guò)毒力測(cè)定對(duì)西花薊馬有高效致病力的球孢白僵菌DZDC-9為供試菌株，以快速獲得菌絲和芽生孢子產(chǎn)量為目的，采用單因素分析的方法從營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件兩方面對(duì)球孢白僵菌液體發(fā)酵階段生長(zhǎng)的影響因子進(jìn)行研究，對(duì)篩選出來(lái)的關(guān)鍵因子進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，篩選出適合液體培養(yǎng)的優(yōu)化組合培養(yǎng)條件，以期快速獲得大量菌絲和芽生孢子，為后期固體接種提供優(yōu)質(zhì)發(fā)酵液，再通過(guò)后期培養(yǎng)驗(yàn)證，以期提高后期發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)所用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)DZDC-9菌株分離自被感染的亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)蟲體，經(jīng)過(guò)毒力測(cè)定該菌株對(duì)西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)有高致病力，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜害蟲組。

1.2 供試培養(yǎng)基

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：2%玉米粉、1%麥麩、0.5%蛋白胨、0.3% KH2PO4、0.1% NH4NO3、0.1% MgSO4·7H2O、2%瓊脂粉，121 ℃高溫滅菌15 min，倒在直徑9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，凝固后備用。

液體培養(yǎng)基：4%葡萄糖、1%蛋白胨，自然pH(經(jīng)pH計(jì)測(cè)定為6.5)，121 ℃高溫滅菌15 min。

試劑：試驗(yàn)所用KH2PO4、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KCl、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純，麥麩和玉米粉為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)出售，瓊脂粉為日本進(jìn)口，蛋白胨為進(jìn)口OXOID LP0042。

1.3 菌株活化與培養(yǎng)

菌株活化培養(yǎng)：取保存于4 ℃的DZDC-9菌株，采用畫線法接種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱(GXZ-9240A型)半光照L∥D=12 h∥12 h培養(yǎng)7 d，待長(zhǎng)出淡黃色分生孢子粉時(shí)備用。

孢懸液的制備：取活化培養(yǎng)的分生孢子粉加入0.05%吐溫-80無(wú)菌水中，使用漩渦振蕩儀振蕩使孢子分散均勻，制得孢懸液。

萌發(fā)率測(cè)定：取少量孢懸液加入裝有15 mL液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，置于26 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h后，取少量培養(yǎng)液滴于血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡(OLYMPUS DP72)40倍下鏡檢，每次計(jì)數(shù)100個(gè)孢子，長(zhǎng)出芽管的記為已萌發(fā)，重復(fù)3次，測(cè)定孢子萌發(fā)率在95%以上，孢子粉可以使用。

1.4 菌絲生長(zhǎng)量和芽生孢子濃度的測(cè)定

菌絲生長(zhǎng)量測(cè)定：取液體發(fā)酵菌液2 mL于離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，沉積物倒在干燥的濾紙(提前烘干至恒重并稱重記為W1)，80 ℃烘干至恒重，快速稱重W2，以菌絲干重來(lái)衡量菌株的生長(zhǎng)多少，W=(W2-W1)×500 g/L。

芽生孢子濃度的測(cè)定：取液體發(fā)酵菌液1 mL加入9 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，使菌絲與芽生孢子分散均勻，取少量混合液滴于血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡40倍下計(jì)數(shù)芽生孢子濃度。

1.5 不同碳氮源種類對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)的影響

氮源種類的影響：分別以牛肉膏和酵母粉為氮源代替液體培養(yǎng)基中的蛋白胨，把50 mL培養(yǎng)液裝入250 mL三角瓶中，接入孢懸液使得培養(yǎng)濃度為107個(gè)/mL，置于26 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床(HZQ-F100振蕩培養(yǎng)箱)培養(yǎng)72 h后，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量和芽生孢子濃度，重復(fù)3次。

碳源種類的影響：分別以甘露醇、蔗糖和麥芽糖為碳源代替液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，把50 mL培養(yǎng)液裝入250 mL三角瓶中，參照固定碳源的培養(yǎng)方法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量和芽生孢子濃度。

1.6 鉀對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)的影響

在液體培養(yǎng)基中添加不同量的KCl，配成不同濃度的含鉀培養(yǎng)液(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mol/L)，把50 mL培養(yǎng)液(不同鉀濃度)裝入250 mL三角瓶中，參照1.5的培養(yǎng)方法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量和芽生孢子濃度。

1.7 單因素分析法對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)條件的篩選

采用單因素分析法對(duì)白僵菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的條件初始pH、培養(yǎng)溫度、初始接菌量、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速和液體裝樣量進(jìn)行篩選。

搖瓶培養(yǎng)方法：取液體培養(yǎng)基50 mL裝入250 mL三角瓶滅菌備用，接入孢懸液使培養(yǎng)濃度為106個(gè)/mL，置于26 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)，自培養(yǎng)開(kāi)始，每隔12 h取樣測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量，重復(fù)3次，取平均值。

不同初始pH：通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加HCl和NaOH來(lái)調(diào)節(jié)初始pH分別為5、6、7、8，其余培養(yǎng)條件不變，測(cè)定不同初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

不同液體裝樣量：分別改變液體培養(yǎng)基裝樣量為1/3、1/4、1/5、1/6，其余培養(yǎng)條件不變，測(cè)定不同液體裝樣量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

不同培養(yǎng)溫度：分別改變搖床培養(yǎng)溫度為24、26、28、30 ℃，其余培養(yǎng)條件不變，測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速：分別改變搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100、200、300 r/min，其余培養(yǎng)條件不變，測(cè)定不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

不同初始接菌濃度：分別在液體培養(yǎng)基接入定量孢懸液使得初始培養(yǎng)濃度為105、106、107、108個(gè)/mL，其余培養(yǎng)條件不變，測(cè)定不同初始接菌濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.8 利用正交設(shè)計(jì)對(duì)篩選因子進(jìn)行優(yōu)化組合

通過(guò)單因素分析的方法，篩選對(duì)菌株液體生長(zhǎng)有影響的因子：初始接菌量、液體裝樣量、轉(zhuǎn)速、溫度和初始pH，對(duì)其中有主要影響作用的接菌量、液體裝樣量、轉(zhuǎn)速，采用L9(34)的正交表進(jìn)行3因子的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因子取3個(gè)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以培養(yǎng)60 h后的菌絲干重為菌株生長(zhǎng)檢測(cè)指標(biāo)。

1.9 優(yōu)化結(jié)果對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

以優(yōu)化得到的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行液體發(fā)酵液培養(yǎng)，得到的培養(yǎng)液接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以大米為固體載體，大米制備和接種培養(yǎng)參照李銀平[14]的生產(chǎn)培養(yǎng)方式，以優(yōu)化前的培養(yǎng)基(4%葡萄糖、1%蛋白胨)和培養(yǎng)方式(初始接種106個(gè)/mL、裝樣2/5、26 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min)[14]為對(duì)照進(jìn)行固體接種培養(yǎng)，試驗(yàn)分3次進(jìn)行，每次每個(gè)處理培養(yǎng)大米10 kg，使用15 cm×30 cm保鮮袋每袋裝大米200 g,接種15%的液體發(fā)酵液，26 ℃半光照L∥D=12 h∥12 h培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)孢量和培養(yǎng)過(guò)程菌米的污染情況以及孢子粉的含孢量、含水量、萌發(fā)率進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)孢量：把培養(yǎng)好的菌米用收孢機(jī)(Mycoharvester Company,UK)進(jìn)行孢子粉的分離，得到的孢子粉稱重，換算成每千克大米的產(chǎn)孢量(g/kg)。

含孢量：準(zhǔn)確稱取孢子粉10 mg加入100 mL0.05%吐溫-80溶液中，使用振蕩儀充分振蕩使孢子成單孢分散，用血球計(jì)數(shù)板40倍鏡檢孢懸液濃度，換算成每克孢子粉所含有的孢子個(gè)數(shù)(個(gè)/g)。

含水量：用水分測(cè)定儀(FD-C1 13060325)測(cè)定孢子的含水量。

萌發(fā)率：參照1.3的方法。

雜菌污染率：培養(yǎng)結(jié)束后，保鮮袋中培養(yǎng)的大米出現(xiàn)雜菌記為污染，統(tǒng)計(jì)被污染的菌米袋數(shù)占培養(yǎng)總袋數(shù)的百分比。

1.10 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 13.0進(jìn)行差異顯著性分析和正交設(shè)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)通過(guò)SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮源對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)的影響

不同氮源影響白僵菌菌株液體生長(zhǎng)情況如圖1顯示，3種有機(jī)氮源對(duì)白僵菌菌株DZDC-9菌絲生長(zhǎng)(F=100.658，P<0.000 1)和芽生孢子濃度(F=327.015，P<0.000 1)有顯著性差異，其中菌株在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)量和芽生孢子濃度均最大，72 h菌絲干重達(dá)到(11.602±0.003 8)g/L，芽生孢子濃度(2.875±0.137 7)×107個(gè)/mL，顯著優(yōu)于蛋白胨和牛肉膏，說(shuō)明酵母粉是菌株DZDC-9液體發(fā)酵的適合氮源。

圖1 不同氮源對(duì)DZDC-9菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain DZDC-9

不同碳源對(duì)菌株的液體生長(zhǎng)影響不同，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，4種不同碳源條件下，菌株DZDC-9菌絲生長(zhǎng)(F=10.749，P<0.004)和芽生孢子濃度(F=60.397,P<0.001)均有顯著性差異，其中菌株在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)量最大，72 h干重達(dá)到(12.606 7±0.747 2)g/L，但芽生孢子濃度顯著低于其他3種碳源；菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)液中芽生孢子濃度最大，72 h芽生孢子濃度達(dá)到(4.406 7±0.120 9)×108個(gè)/mL,在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)液中，菌絲干重的產(chǎn)量也相對(duì)較高，所以葡萄糖更適合菌株DZDC-9的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

圖2 不同碳源對(duì)DZDC-9菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the growth of strain DZDC-9

2.2 不同鉀濃度對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)的影響

在培養(yǎng)液中添加不同濃度的KCl，菌株生物量(F=477.769,P<0.000 1)和芽生孢子濃度(F=97.553,P<0.000 1)有顯著性差異，如圖3所示隨著培養(yǎng)液中鉀離子濃度的增加，菌絲干重呈下降趨勢(shì)，當(dāng)鉀離子濃度達(dá)到0.025 mol/L時(shí)，菌絲干重(15.291 3±0.123 7)g/L低于對(duì)照菌絲干重(16.324 0±0.140 1)g/L，芽生孢子濃度隨著鉀離子濃度的增大呈現(xiàn)先下降然后略微上升的趨勢(shì)，但在鉀離子濃度高于0.000 5 mol/L后菌絲干重和芽生孢子濃度都顯著低于對(duì)照，適量的鉀離子濃度(0.000 5 mol/L)對(duì)菌株DZDC-9液體發(fā)酵生物量和芽生孢子濃度有明顯的促進(jìn)作用，反之則抑制菌株的生長(zhǎng)。

圖3 不同KCl濃度對(duì)DZDC-9菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different KCl concentrations on the growth of strain DZDC-9

2.3 單因素分析法對(duì)球孢白僵菌菌株液體培養(yǎng)條件的篩選

采用單因素分析的方法分別對(duì)培養(yǎng)液初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和初始接菌濃度進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果如圖4～8，可以看出在液體培養(yǎng)的前36 h菌株生長(zhǎng)速度快，36 h以后生長(zhǎng)緩慢，60 h生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)達(dá)到最高生長(zhǎng)量，培養(yǎng)72 h菌株生長(zhǎng)量略有下降，出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象(通過(guò)培養(yǎng)液的觀察可以看到有少許分層現(xiàn)象出現(xiàn))。試驗(yàn)選取白僵菌菌株生長(zhǎng)量最高點(diǎn)進(jìn)行因子的顯著性分析，通過(guò)不同條件下菌株生長(zhǎng)曲線可以看到菌株生長(zhǎng)都在60 h穩(wěn)定達(dá)到生長(zhǎng)高峰。通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)條件下60 h菌體的生長(zhǎng)量進(jìn)行顯著性差異分析，其中液體裝樣量(F=7.381,P<0. 011)、溫度(F=11.836,P<0.003)、轉(zhuǎn)速(F=7.929,P<0.021)和接菌量(F=26.578,P<0.000 1)對(duì)菌株的液體培養(yǎng)有顯著性影響，而初始pH(F=2.653,P>0.05)則對(duì)菌株生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性影響，在菌株液體培養(yǎng)時(shí)選取液體培養(yǎng)基自然pH(6.5)進(jìn)行培養(yǎng)即可，液體培養(yǎng)溫度選擇常規(guī)培養(yǎng)溫度26 ℃。

圖4 初始pH對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different initial pH values on the growth of strain DZDC-9

圖5 裝樣量對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different volumes of culture medium on the growth of strain DZDC-9

圖6 溫度對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the growth of strain DZDC-9

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different rotation speeds on the growth of strain DZDC-9

圖8 不同接菌量對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of different spore concentrations on the growth of strain DZDC-9

2.4 利用正交設(shè)計(jì)對(duì)液體培養(yǎng)主要影響條件進(jìn)行優(yōu)化篩選

按照正交設(shè)計(jì)表L9(34)對(duì)白僵菌菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化組合，所得結(jié)果見(jiàn)表1和表2，對(duì)試驗(yàn)的不同組合之間進(jìn)行方差分析，不同培養(yǎng)方式菌株菌絲生長(zhǎng)量有顯著性差異(F=644.546，P<0.000 1)，試驗(yàn)編號(hào)8的組合方式顯著優(yōu)于其他組合。對(duì)各因子進(jìn)行主效應(yīng)分析，從表2可以看出，初始接菌量對(duì)菌絲生長(zhǎng)量有顯著影響，而培養(yǎng)基裝樣量和轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響則不顯著，初始接菌量是影響菌株液體生長(zhǎng)的最顯著因子。

2.5 優(yōu)化后的發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證

分別以優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行接種試驗(yàn)，以優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為對(duì)照，對(duì)收獲后的孢子粉進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如表3，可以看出優(yōu)化后接種產(chǎn)孢量大幅度增加，與優(yōu)化前在P=0.05水平上有顯著性差異，并且優(yōu)化后接種在固體培養(yǎng)時(shí)，雜菌污染率大幅度降低，這主要是由于優(yōu)化后培養(yǎng)得到的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵液在固體培養(yǎng)的前期生長(zhǎng)速度較快，抑制了雜菌的生長(zhǎng)。

表1 菌株培養(yǎng)條件的正交設(shè)計(jì)表1)Table 1 The orthogonal array form of strain culture

1) 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)過(guò)Duncan氏多重比較在0.05水平上有顯著性差異。
Different lowercase letters indicate significant difference by Duncan’s test (P<0.05).

表2 正交試驗(yàn)的主效應(yīng)分析結(jié)果Table 2 The results of orthogonal array form

表3 優(yōu)化培養(yǎng)條件的生產(chǎn)試驗(yàn)1)Table 3 Experimental verification of yielding capacity under the optimized fermentation conditions

1) 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)過(guò)獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)在0.05水平上有顯著性差異。
Different lowercase letters in the same column indicate significant difference by dependent samplet-test (P<0.05).

3 討論

不同菌株對(duì)碳氮源的需求和利用情況不同，微量元素的種類和添加量也會(huì)對(duì)菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)球孢白僵菌菌株DZDC-9發(fā)酵生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求的研究，發(fā)現(xiàn)適宜該菌株生長(zhǎng)的碳源是葡萄糖，氮源是酵母粉，宋漳[15]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖和乳糖是白僵菌液體培養(yǎng)較好的碳源，樊金華等[16]的研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源更適合菌株液體發(fā)酵，孔瓊等[11]也研究表明葡萄糖和酵母浸粉最有利于菌落擴(kuò)展和產(chǎn)孢量的增加，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符。朱天輝等[12]在球孢白僵菌的液體培養(yǎng)中添加了0.1%K2PO4得到了最大芽生孢子濃度，本試驗(yàn)在液體培養(yǎng)基中添加KCl測(cè)定了鉀添加量對(duì)菌株液體生長(zhǎng)的影響，研究表明在液體培養(yǎng)基中添加適宜濃度的KCl可以顯著提高菌絲和芽生孢子濃度。

對(duì)于發(fā)酵條件，本試驗(yàn)首先通過(guò)單因子分析從5個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)初始pH在5～8范圍對(duì)菌株生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性影響，孫明[17]等報(bào)道過(guò)球孢白僵菌的液體培養(yǎng)在pH為5～6的偏酸性環(huán)境下產(chǎn)孢量最大，這與本試驗(yàn)結(jié)果存在一些差異，可能是不同菌株對(duì)pH的需求不同，在一定的pH范圍內(nèi)菌株可以維持正常生長(zhǎng)，過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境不利于菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。菌株生長(zhǎng)的適宜溫度是26 ℃，Thomas[18]曾研究報(bào)道過(guò)適宜白僵菌液體生長(zhǎng)的溫度為25 ℃。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)速、接菌量和裝樣量進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在初始接菌濃度107個(gè)/mL、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝樣量1/5的培養(yǎng)條件下，菌株生長(zhǎng)量最大，充分證明了合適的溶氧可以明顯促進(jìn)菌株液體生長(zhǎng)，過(guò)高或過(guò)低的接種量均不利于液體發(fā)酵生產(chǎn)，過(guò)高的接種量需要更多的種子懸浮液，但對(duì)于后期發(fā)酵液的產(chǎn)量并沒(méi)有顯著的增加作用，過(guò)低的接種量造成發(fā)酵周期延長(zhǎng)。通過(guò)優(yōu)化后的培養(yǎng)液進(jìn)行固體接種試驗(yàn)，并與優(yōu)化前進(jìn)行對(duì)比，不僅增加了菌株產(chǎn)孢量，后期固體接種的雜菌率也大幅降低。

球孢白僵菌對(duì)多種害蟲有控制效果，在生物防治中發(fā)揮著重要作用[19-20]。經(jīng)過(guò)分離篩選得到對(duì)西花薊馬有高效致病力的菌株DZDC-9，對(duì)菌株的液體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)和條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，為菌株DZDC-9的擴(kuò)大生產(chǎn)和田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)本次的試驗(yàn)優(yōu)化，菌株的液體發(fā)酵需要60 h即可達(dá)到最大生長(zhǎng)量，通過(guò)后期的接種試驗(yàn)得到的孢子粉產(chǎn)量多于優(yōu)化前的接種產(chǎn)量。除此之外，球孢白僵菌對(duì)于碳氮源的濃度需求也不盡相同，其他微量元素的添加對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響尚不明確，還需要做進(jìn)一步的研究和探索，為球孢白僵菌的規(guī)?；a(chǎn)提供更多的理論基礎(chǔ)。

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OptimizationofsubmergedcultureconditionsforblastosporeandbiomassproductionofBeauveriabassiana

Zhang Yaping, Wu Shengyong, Wang Haihong, Lei Zhongren

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China)

The principal objectives of this study were to determine the optimal liquid culture conditions in shake flasks for maximal biomass and blast spores ofBeauveriabassiana. The results showed that glucose was the suitable carbon source, and yeast powder was the suitable nitrogen source for the growth of strain DZDC-9. Adding 0.000 5 mol/L KCl into the submerged culture can significantly enhance the yield of biomass and blast spores. The biomass reached(13.184±0.328 6)g/L after 60 h. The best culture conditions were shake flasks with one-fifth nutrient solution and initial conidial concentration of 107spores/mL in a rotary shaking incubator at 200 r/min at 26 ℃, which could increase the biomass and shorten the incubation time. Using the selected nutrition and culture conditions to produce conidia, the yield could achieve 22.30±1.78 per kilogram of rice.

Beauveriabassiana; liquid fermentation; nutrition; culture condition; yield

2013-12-18

：2014-05-27

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-25)；北京市國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城產(chǎn)業(yè)培育專項(xiàng)(Z121100001212006)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.016

* 通信作者 E-mail: leizhr@sina.com