王貽蓮， 陳 凱， 李 哲， 吳遠征， 郭 凱， 李紀順， 楊合同

(山東省科學院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014)

越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的分離鑒定

王貽蓮， 陳 凱， 李 哲， 吳遠征， 郭 凱， 李紀順， 楊合同*

(山東省科學院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014)

為探尋越南伯克霍爾德氏菌B418代謝產(chǎn)物中的殺線蟲活性物質(zhì)，采用色譜分離技術(shù)和活性跟蹤的方法，從越南伯克霍爾德氏菌B418代謝產(chǎn)物中分離鑒定出六氫-3-(異丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氫-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮兩種活性化合物。生物測定結(jié)果顯示，兩化合物在相對含量比為2.81∶1，使用濃度為20 mg/mL情況下，對南方根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲48 h校正致死率分別為60.45%和67.37%，即對南方根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲均有殺蟲活性。

越南伯克霍爾德氏菌； 代謝產(chǎn)物； 分離鑒定； 殺線活性； 生物測定

植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物，其危害超過細菌和病毒，僅次于真菌病害[1-2]。據(jù)估計，全球每年由于植物寄生線蟲所造成的損失達1 250億美元[2]，這一損失的70%是由根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)所造成[3]。根結(jié)線蟲寄主范圍極廣，可危害30多種常見蔬菜，且以種植面積較大的番茄、黃瓜、芹菜等受害最重，已成為蔬菜生產(chǎn)中的嚴重問題之一[4]。生物防治因具有除害增產(chǎn)、保護生態(tài)平衡、減輕環(huán)境污染等作用[5]，受到越來越多的關注，正成為根結(jié)線蟲治理的首選措施。

越南伯克霍爾德氏菌(BurkholderiavietnamiensisGillis, Van, Bardin, Goor, Hebbar,Willems, Segers, Kersters, Heulin and Fernandez 1995) B418是山東省科學院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存的多功能生防菌株，能夠有效防治根結(jié)線蟲病。田間試驗表明，B418對番茄根結(jié)線蟲病的防治效果為63.42%，對茄子根結(jié)線蟲的防治效果為75.60%[6-7]。室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，B418發(fā)酵液上清液處理2齡根結(jié)線蟲6 h后校正死亡率達70%以上。這些都表明，B418菌株能產(chǎn)生殺線蟲活性物質(zhì)。因此，本研究對越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性物質(zhì)進行了分離鑒定，旨在為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌：越南伯克霍爾德氏菌(B.vietnamiensis)B418，山東省科學院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存。

供試線蟲：南方根結(jié)線蟲(M.incognita)，實驗室保存；秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)，中國科學院微生物研究所真菌地衣系統(tǒng)學重點實驗室劉杏忠研究員贈送。

B418固體培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，NaCl 0.02 g，CaCl20.2 g，NaMoO4·2 H2O 0.002 g，乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.066 g，谷氨酸鈉0.05 g，葡萄糖5 g，瓊脂15 g，pH 7.2～7.4。

B418液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母浸出物1 g，CaCl20.2 g，pH 7.2～7.4。

試驗試劑：氯仿、二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亞砜。

試驗儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(AGILENT 6890GC/5973 MS)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)和色譜用硅膠H(青島海洋化工廠)；電子天平(HANGPING FA1004N)；恒溫搖床(培英DHZ-D)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備及檢測方法

1.2.1.1樣品制備

將培養(yǎng)好的10 L發(fā)酵液離心(8 000 r/min)，上清液用2倍體積氯仿萃取2次，合并有機相，減壓濃縮除去氯仿，得粗提物。將粗提物過真空減壓-硅膠柱(5 cm×100 cm)，以不同體積比的甲醇-二氯甲烷洗脫體系進行洗脫，甲醇-二氯甲烷洗脫體系比分別為0∶100(A)、1∶100(B)、3∶100(C)、5∶100(D)、10∶90(E)、20∶80(F)、30∶70(G)、50∶50(H)、100∶0(I)，各1000 mL，洗脫液以體積比為單位進行收集，測定各單位的殺線蟲活性。將高活性(C、D)組分過Sephadex LH-20凝膠柱(1.5 cm×60 cm)，用石油醚-甲醇-二氯甲烷(體積比為2∶1∶1)進行洗脫，洗脫液以5 mL為單位進行收集，測定各單位的殺線蟲活性。繼續(xù)將高活性組分D-6用制備型薄層層析硅膠板進行分離，展開劑為石油醚-乙酸乙酯(體積比1∶1)，結(jié)合離體生測找出活性條帶后，用正己烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)淋洗過濾，收集活性條帶，減壓濃縮得終樣品，測定殺線蟲活性，并用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC/MS)檢測鑒定終樣品。

1.2.1.2色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Agilent19091S-433色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度290 ℃，壓力8.78 psi，載氣He，恒流模式，柱流速1.0 mL/min，脈沖不分流，進樣量1.0 μL。

升溫程序：溶劑延遲5 min，初溫70 ℃保留3 min，再以8 ℃/min速率升溫至300 ℃保留15 min。

質(zhì)譜條件：采集模式：全掃描；EMV模式：相對值；全掃描參數(shù)：初始質(zhì)量數(shù)29 amu，終止質(zhì)量數(shù)600 amu；MS溫度：離子源230 ℃，MS四級桿150 ℃。

1.2.2 生物測定

1.2.2.1樣品定性測定方法

將分離的活性物質(zhì)加到濾紙片上，待有機溶劑揮發(fā)后，用滅菌水稀釋成10倍的溶液，分別取稀釋液100 μL加入到24 孔板中，加入2齡幼蟲懸浮液(400頭/mL)100 μL，在相對濕度80%～90%，溫度24～26 ℃條件下培養(yǎng)，以滅菌水為對照，每處理6次重復。

1.2.2.2樣品定量測定方法

用二甲基亞砜溶解樣品后，用滅菌水稀釋成不同濃度的溶液，分別取待測溶液150 μL加入到24 孔板中，加入2齡幼蟲懸浮液(400 頭/mL)50 μL，在相對濕度80%～90%，溫度24～26 ℃條件下培養(yǎng)，以體積分數(shù)為3%的二甲基亞砜水溶液作對照，每處理6次重復。

分別于24 h或48 h后統(tǒng)計線蟲死亡數(shù)，線蟲僵直不動的為死蟲，呈彎曲蠕動狀態(tài)的為活蟲。按下列公式計算死亡率和校正死亡率。

線蟲死亡率(%) = 死蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100;

線蟲校正死亡率(%) =(處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率)×100。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)IBM SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠柱層析組分對根結(jié)線蟲2齡幼蟲的生物測定結(jié)果

由表1可知，B418發(fā)酵液粗提物經(jīng)硅膠柱層析后，所得組分中C和D殺線蟲活性高。其中，兩組分在稀釋20倍時，處理24 h后對根結(jié)線蟲2齡幼蟲校正死亡率分別為44.65%和84.18%。故將C和D組分分別經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，繼續(xù)分離純化殺線蟲活性物質(zhì)。

表1硅膠柱層析組分對根結(jié)線蟲2齡幼蟲的生物測定1)

Table1BioassayofsilicagelcolumnchromatographycomponentstotheJ2ofMeloidogyneincognita

組分編號Number甲醇?二氯甲烷洗脫體系體積比Volumeratioofmethanol?methylenechlorideelutionsystem24h校正死亡率/%Correctedmortalityat24hA0∶100(4．05±0．08)cB1∶100(5．05±0．10)cC3∶100(44．65±3．89)abD5∶100(84．18±5．02)aE10∶90 (17．40±2．11)cF20∶80 (36．04±3．97)bG30∶70 (10．81±1．10)cH50∶50 (22．07±1．46)bcI100∶0 (11．19±0．93)c

1) 樣品稀釋20倍。表中數(shù)據(jù)為6次重復的平均值。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示鄧肯新復極差測驗差異顯著(P<0.05)。表2同。
Samples were diluted 20-fold. Data in the table are mean of 6 replicates. Means followed by different letters within a column are significantly different (P<0.05, Duncan’s test), the same as table 2.

2.2 凝膠柱層析組分對根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒力測定結(jié)果

由表2可知，活性組分經(jīng)凝膠柱層析后，所得D-6組分殺線蟲活性最高。在樣品稀釋20倍時，處理48 h后，對根結(jié)線蟲2齡幼蟲校正死亡率為44.74%，且顯著高于其他處理。故將其用制備型薄層層析硅膠板繼續(xù)分離。

表2凝膠柱層析組分對根結(jié)線蟲2齡幼蟲的生物測定

Table2BioassayofgelcolumnchromatographycomponentstotheJ2ofM.incognita

組分編號Number48h校正死亡率/%Correctedmortalityat48h組分編號Number48h校正死亡率/%Correctedmortalityat48h組分編號Number48h校正死亡率/%Correctedmortalityat48hD?1(11．41±0．92)cD?10(24．19±1．87)bD?21(12．23±1．47)cD?3(11．34±1．32)cD?11(7．42±0．69)cC?2(9．38±1．50)cD?4(20．00±1．03)bD?12(16．80±2．22)bcC?3(10．34±2．01)cD?5(20．27±2．10)bD?13(20．83±1．05)bC?4(7．95±1．02)cD?6(44．74±2．32)aD?14(13．19±1．63)cC?5(6．24±0．83)cD?7(12．50±0．91)cD?15(14．29±0．78)bcC?6(13．23±3．14)cD?8(15．52±3．34)bcD?16(10．88±1．93)cC?7(9．30±1．23)cD?9(12．81±1．45)cD?17(21．00±3．74)bC?11(8．64±0．96)c

2.3 薄層層析回收樣品對2齡根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲的生物測定結(jié)果

由表3可知，用制備型薄層層析硅膠板回收的3個樣品中，D-6-3對線蟲致死率最高，在使用濃度為20 mg/mL時，處理線蟲48 h后，對南方根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲的校正死亡率分別達60.45%和67.37%。

2.4 薄層層析回收樣品D-6-3 GC-MS定性分析

對D-6-3進行了GC-MS定性分析，得到其總離子流圖，見圖1。在GC指紋圖譜中，在保留時間為21～23 min區(qū)域中，共有2個物質(zhì)的色譜峰，分別為六氫-3-(異丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氫-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

表3薄層層析硅膠板回收樣品對2齡根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲的生物測定1)

Table3BioassayofsamplesrecoveredfromTLCsilicagelplatetotheJ2ofM.incognitaandCaenorhabditiselegans

回收樣品Recyclingsamples供試線蟲Testnematodes使用濃度/mg·mL-1Concentration48h校正死亡率/%Correctedmortalityat48hD?6南方根結(jié)線蟲M．incognita9．4(54．36±3．11)b18．8 (70．24±5．24)a秀麗隱桿線蟲C．elegans9．4(60．68±2．23)ab18．8 (75．77±3．85)aD?6?1南方根結(jié)線蟲M．incognita10．0 (5．99±1．10)e20．0 (7．45±0．76)de秀麗隱桿線蟲C．elegans10．0 (6．43±0．63)de20．0 (7．50±1．31)de

續(xù)表3

Table3(Continued)

回收樣品Recyclingsamples供試線蟲Testnematodes使用濃度/mg·mL-1Concentration48h校正死亡率/%Correctedmortalityat48hD?6?2南方根結(jié)線蟲M．incognita10．0(8．90±1．59)de20．0 (10．93±0．83)d秀麗隱桿線蟲C．elegans10．0 (9．36±0．97)de20．0(11．47±0．98)dD?6?3南方根結(jié)線蟲M．incognita10．0(38．52±1．33)c20．0 (60．45±2．59)ab 秀麗隱桿線蟲C．elegans10．0(42．79±1．47)c20．0(67．37±4．85)ab

1) 表中數(shù)據(jù)為6次重復的平均值。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示鄧肯新復極差測驗差異顯著(P<0.05)。
Data in the table is mean, means followed by the different letter within a column are significantly different (P< 0.05, Duncan’s test).

圖1 D-6-3 GC離子流圖

經(jīng)過GC/MS分析，所得質(zhì)譜經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對其內(nèi)存譜庫nist庫自動搜索，并結(jié)合人工譜圖解析，按各色譜峰的質(zhì)譜裂片圖或與相關文獻核對，分別對各色譜峰加以確定。各成分的相對面積用面積歸一化法來計算。在D-6-3中檢測出匹配度在90%以上的物質(zhì)，分別是六氫-3-(異丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氫-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，相對含量分別為73.75%和26.25%。

表4D-6-3氣質(zhì)聯(lián)用測定結(jié)果

Table4TheresultsofD-6-3GC/MS

編號NumberCAS號CASNo．保留時間/minRetentiontime分子式Formula化合物名稱Compoundname結(jié)構(gòu)式Structure匹配度/%Matchingdegree相對含量/%Relativecontent化合物ⅠCompoundⅠ2873?36?121～22C11H18N2O2六氫?3?(異丙基)?吡咯并[1，2?a]吡嗪?1，4?二酮Pyrrolo[1，2?a]pyrazine?1，4?dione，hexahydro?3?(2?methylpropyl)-90．973．75化合物ⅡCompoundⅡ14705?60?322～23C14H16N2O2六氫?3?(苯甲基)?吡咯并[1，2?a]吡嗪?1，4?二酮Pyrrolo[1，2?a]pyrazine?1，4?dione，hexahydro?3?(phenylmethyl)-91．426．25

3 討論

越南伯克霍爾德氏菌B418具有防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時，其在植物根際和土壤中的有效定殖受自然環(huán)境(如土壤有機質(zhì)、水分、pH、溫度)與土著微生物區(qū)系的影響[8-9]，這些因素嚴重制約著B418菌株的田間防治效果。因此，對越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性物質(zhì)進行分離鑒定，研究其化學結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，利于闡明B418菌株防治根結(jié)線蟲病的作用機理，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

本文采用色譜分離技術(shù)和活性跟蹤的方法，從越南伯克霍爾德氏菌B418菌株代謝產(chǎn)物中分離鑒定出六氫-3-(異丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氫-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮兩種活性化合物。六氫-3-(異丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，別名環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)，英文名pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)-，匹配度90.9%，相對含量73.75%，CAS號2873-36-1，分子式C11H18N2O2，分子量210。六氫-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，別名環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)，英文名pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(phenylmethyl)-，匹配度91.4%，相對含量26.25%，CAS號14705-60-3，分子式C14H16N2O2，分子量244。兩活性化合物均屬于環(huán)二肽，該類化合物在人、脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌和細菌中均有發(fā)現(xiàn)[10]。

環(huán)二肽結(jié)構(gòu)不同，其生物功能顯著不同[11]。趙文英等[12]和李冬等[13]報道，海洋放線菌Streptomycessp. 3275和H2003代謝產(chǎn)生的環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)對小鼠乳腺癌細胞tsFT210表現(xiàn)出弱的抗腫瘤活性。嚴濤等[14]報道，環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)對海洋生物在固體上的附著具有顯著的抑制作用。Strom 等[15]報道，環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)有抗真菌活性，對煙曲霉(AspergillusfumigatusFres.)和青霉(PenicilliumroquefortiThom)的最低抑菌濃度為20 mg/mL，并與苯乳酸存在弱協(xié)同效應。李明智[16]的研究表明，黃單胞菌(Xanthomonasretroflexus)L4代謝產(chǎn)生的環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、胞外多糖和6種有機酸具有除草活性。王艾晶等[17]、漆淑華等[18]、Wang 等[19]報道，環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、黃瓜菌核病(Sclerotiniarot)、玉米彎孢病菌(Curvularialunata)等植物病原菌及凍土毛霉(Mucorhiemalis)、黃曲霉(A.flavus)、米根霉(Rhizopusoryzae)等食品腐敗菌均具有較強的抑制作用，對枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(EscherichiacoliDH5a)具有抑制作用，并能抑制多種能誘導海洋生物(如藤壺、草苔蟲)幼蟲附著的細菌(Loktanellahongkongensis,Micrococcusluteus,Ruegeriasp.,Bacilluscereus)的生長。王建華等[20]報道，環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)對金黃色葡萄球菌(S.aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)等致病菌的生物膜有很強的抑制作用，在環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)的濃度達到10 mg/mL時，S.aureus和P.aeruginosa的生物膜幾乎消失；在環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)的濃度達到12 mg/mL時，C.albicans的生物膜被顯著抑制。該發(fā)現(xiàn)為尋找新的有效生物膜抑制劑奠定了基礎。吳瑨等[10]報道，海藻來源的黃曲霉(A.flavus)代謝產(chǎn)物環(huán)(L-脯-L-苯丙)二肽可能成為潛在的磷酸二酯酶抑制劑。因此，該化合物在農(nóng)藥、食品及醫(yī)藥等開發(fā)研究領域中具有廣闊的應用前景。

環(huán)二肽作為生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑藻及抗污、抗氧化、降血糖等生理活性，還可作為植物生長調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑和免疫增強劑[21]。但到目前為止，未見環(huán)二肽對線蟲具有抑、殺活性的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，B418產(chǎn)生的環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)和環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)對南方根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲均有殺蟲活性，兩化合物在相對含量比為2.81：1，使用濃度為20 mg/mL時，對南方根結(jié)線蟲和秀麗隱桿線蟲的48 h校正死亡率分別為60.45%和67.37%。至于兩者間是否存在協(xié)同效應，以及其對線蟲的作用機制均有待進一步研究。

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IsolationandidentificationofnematicidalactivesubstancefromBurkholderiavietnamiensisB418

Wang Yilian, Chen Kai, Li Zhe, Wu Yuanzheng, Guo Kai, Li Jishun, Yang Hetong

(BiotechnologyCenterofShandongAcademyofSciences，ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedMicrobiology，Ji’nan250014,China)

Chromatographic separation techniques and activity tracking methods were used to determine the nematicidal active substances fromBurkholderiavietnamiensisB418 metabolites. The isolated compounds were identified as derivative of diketopiperazine: hexahydro-3-(2-methylpropyl)-pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione and hexahydro-3-(phenylmethyl)-pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione. Nematicidal bioassay showed the corrected mortalities againstMeloidogyneincognitaandCaenorhabditiseleganswere 60.45% and 67.37% after 48 h, respectively, with two compounds at the ratio of 2.81∶1 and the concentration of 20 mg/mL.

Burkholderiavietnamiensis; metabolite; isolation and identification; nematicidal activity; bioassay

2014-01-21

：2014-05-07

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金(BS2010NY024)；山東省留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目(魯人社字[2013]528號)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.04.012

致謝：感謝山東省科學院生物研究所海洋食品研究室的夏雪奎博士和劉新博士在分離鑒定方面的指導。

* 通信作者 E-mail：yanght@sdas.org