何 超， 周鑫鈺， 黃 軍， 劉雙清， 朱宏建*

(1. 湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128； 2. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128; 3.湖南省微生物研究院，長沙 410009)

油菜菌核病菌拮抗放線菌HPS02的分離、鑒定及其代謝產物性質研究

何 超1,2， 周鑫鈺1,2， 黃 軍3， 劉雙清1,2， 朱宏建1,2*

(1. 湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128； 2. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128; 3.湖南省微生物研究院，長沙 410009)

為控制油菜菌核病在油菜生產上的擴散，挖掘該病的生防資源，以油菜菌核病菌為指示菌，從湖南懷化收集的土樣中分離出4株拮抗放線菌株。其中菌株HPS02的抑菌效果最好，無菌發(fā)酵液對油菜菌核病菌的菌絲生長抑制率高達91.04%。經菌株培養(yǎng)性狀、形態(tài)觀察、生理生化鑒定，并結合16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為阿布拉鏈霉菌(Streptomycesaburaviensis)?？咕V研究表明，該菌株對多種植物病原菌都有拮抗作用。發(fā)酵液穩(wěn)定性結果表明，該菌株發(fā)酵液對酸堿較為穩(wěn)定，對溫度、紫外線較為敏感。通過硫酸銨沉淀發(fā)酵液，其沉淀的抑菌活性與發(fā)酵原液一致。經4種不同有機試劑萃取后，萃余相的抑菌活性與原發(fā)酵液的抑菌活性相差很小。該研究結果為油菜菌核病的生物防治提供科學依據。

油菜菌核病菌； 放線菌； 發(fā)酵液； 穩(wěn)定性； 拮抗

油菜菌核病是油菜生產中的重要病害，常年株發(fā)病率高達10%～30%，嚴重的達80%以上；病株一般減產10%～70%。在世界各國油菜生產中該病均造成嚴重減產[1-2]。由于缺乏有效的抗病品種，油菜菌核病的防治主要依賴化學藥劑，但是長期使用化學藥劑容易使病原菌產生抗藥性，并引起食品和環(huán)境污染[3]。因此，利用拮抗微生物或其次生代謝產物進行生物防治成為控制該病害的有效措施[4-6]。其中放線菌是一類重要的生物防治資源，具有重要的研究價值。目前，關于油菜菌核病的生防放線菌報道較多，Tahtamouni等[7]從約旦北部采集的土樣中篩選出40個菌株對核盤菌表現出不同的抑制活性。Castillo等[8]從假山毛櫸等植物中分離得到對核盤菌有抑制作用的內生鏈霉菌。Baniasadi等[9]從伊朗土壤中分離篩選出1株對核盤菌有較好抑制活性的菌株，并通過盆栽試驗驗證了其活性。韓立榮等[10]報道放線菌11-3-1菌株對油菜菌核病菌的抑菌帶寬度可達19.67 mm，其發(fā)酵原液對該病的室內防效優(yōu)于腐霉利，達96.91%。馮俊濤等[11]報道放線菌HJ1-2菌株的發(fā)酵液對油菜菌核病菌的抑制率為100%，主要抑菌活性物質為大環(huán)內酯類抗生素，具有一定的開發(fā)價值。胡磊等從甘肅省鹽堿地分離2株鏈霉菌對油菜菌核病菌的離體防治效果分別達63.5% 和49.1%[12]。

本試驗從懷化通道縣萬佛山采集的土樣中分離、篩選出一株對油菜菌核病有拮抗活性的放線菌HPS02，并結合形態(tài)、培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列對其進行了分類鑒定，另外對其發(fā)酵液的性質進行了研究，旨在為進一步控制該病害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌株HPS02和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)由本課題組分離、保存；供試的10種植物病原菌，即黃瓜疫霉病菌(Phytophthoramelonis)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、馬鈴薯環(huán)腐病菌(Clavibactermichiganensis)、水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)、白菜軟腐病菌(Erwiniacarotovora)由湖南農業(yè)大學植物病理研究室提供。西瓜果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)由中國農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基及試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基用于病原真菌的培養(yǎng)與拮抗活性測定。拮抗放線菌的培養(yǎng)性狀觀察使用PDA、察氏瓊脂、高氏1號、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基。發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為：玉米粉20 g，KNO31 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，CaCO34 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。所用試劑均為長沙鵬潤生物公司提供的市售生化試劑(分析純)。

1.2 放線菌株的分離

用含有3%的K2Cr2O7的高氏1號培養(yǎng)基混合均勻后倒入平板，制成含有抑制劑的選擇培養(yǎng)基平板[13]。采用稀釋分離法[14]分離從懷化通道縣萬佛山所采集土樣中的放線菌。純化后的菌種轉入斜面，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 放線菌株拮抗油菜菌核病菌的測定

按照參考文獻[15]中的方法進行拮抗放線菌的篩選。將PDA培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，待冷卻后每皿中央接種油菜菌核病菌菌餅(直徑5 mm)，于每皿四周接種4種待測放線菌，平均分布于菌餅的4個方向，置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，觀察放線菌株周圍有無抑菌帶，并測量抑菌帶的寬度。

將有拮抗活性的菌株接種于高氏一號液體培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，CaCO34 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2)。28 ℃下搖瓶發(fā)酵72 h。用細菌過濾器過濾發(fā)酵液。

抗真菌活性：在每個無菌培養(yǎng)皿中加入活性菌株過濾液3 mL，倒入PDA培養(yǎng)基(55 ℃左右) 12 mL，搖勻制成平板，待培養(yǎng)基冷卻后，接種4～5 mm的病原菌菌餅，倒置移放到平板中央，重復3次。靜置1 h后放入溫箱，28 ℃下培養(yǎng)5 d。用十字交叉法測量菌落直徑，記錄結果并按下式計算抑制率：

菌落直徑=相垂直的兩直徑的平均值-菌餅直徑；

抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100。

抗細菌活性：將待測病原細菌振蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌懸液加到300 mL PDA培養(yǎng)基中(55 ℃左右)混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿制成平板。冷卻后在平板四周放置3張直徑3 mm的濾紙圓片，每個濾紙片上滴加20 μL活性菌株過濾液。放入28 ℃溫箱培養(yǎng)。3 d后測量抑菌圈直徑，并仔細觀察抑菌圈的透明程度。

1.4 拮抗放線菌菌株鑒定

1.4.1 菌株培養(yǎng)性狀和生理生化特征測定

參照文獻[16]-[17]中介紹的方法進行菌株培養(yǎng)性狀及生理生化測定，菌株孢子形態(tài)掃描電鏡觀察在湖南農業(yè)大學分析測試中心電鏡室進行。

1.4.2 菌株的分子生物學鑒定

(1)菌株基因組DNA的提取: CTAB抽提緩沖液在65 ℃水浴鍋中預熱后吸取1.5 mL于研缽中，然后向研缽中加入石英砂，充分研磨菌絲后將研磨液裝入1.5 mL的離心管中65 ℃水浴30 min，每5 min晃動一次；冷卻至室溫后，加入氯仿-異戊醇(24∶1)振蕩2～3 min，10 000 r/min離心1 min，吸取上清液于另一離心管中，向其加入等體積的無水乙醇，10 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗滌, 10 000 r/min離心30 s，洗滌2次后放置室溫數分鐘后再加入50 μL TE緩沖液，DNA溶解后放置-20 ℃冰箱保存。

(2)菌株16S rDNA的PCR擴增、回收和序列測定：根據放線菌16S rDNA的結構特點及其保守區(qū)設計引物，正向引物16S F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物16S R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。由深圳華大基因有限公司合成。以基因組DNA為模板，進行50 μL反應體系PCR擴增，擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用1.0%的瓊脂糖凝膠對擴增產物電泳檢測，擴增產物切膠回收，送深圳華大基因有限公司測序。

(3)測序及系統(tǒng)發(fā)育分析：將測序獲得的菌株16S rDNA序列，通過GenBank中核酸數據庫進行比對，再用MEGA4.0軟件繪制菌株的系統(tǒng)進化樹。

1.5 菌株HPS02的抗菌譜測定

參照1.3中介紹的方法進行。

1.6 抗菌物質粗提液穩(wěn)定性測定

熱穩(wěn)定性：將發(fā)酵液分別經50、60、70、80、90、100 ℃處理60 min后，以油菜菌核病菌作為指示菌，用含毒介質法測定抑菌活性，以未進行溫度處理的發(fā)酵液作對照。

pH 穩(wěn)定性：將菌株發(fā)酵液用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCL分別調至pH為 4、5、6、7、8、9、10，靜置2 h然后將各pH調回自然pH，進行抑菌活性測定。以未進行pH處理的發(fā)酵液作對照。

紫外照射穩(wěn)定性：將菌株發(fā)酵上清液置于無菌培養(yǎng)皿中，放在距20 W紫外燈下10 cm處分別照射1、3、5、7、9、12 h，用含毒介質法測定其抑菌活性，以未經紫外照射的發(fā)酵液為對照。

1.7 最適硫酸銨飽和度的確定及抗菌物質的提取

將菌株的無菌發(fā)酵液分別加固體硫酸銨至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%飽和度，置4 ℃下過夜。用高速冷凍離心機在4 ℃下10 000 r/min離心20 min。每50 mL培養(yǎng)液所得沉淀用2 mL 20 mmol/L的Tris-HCL(pH 7.5)緩沖液懸浮。用含毒介質法測定沉淀物質懸浮液的抑菌活性，比較其活性差異。

選用氯仿、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇4種不同極性的有機試劑為萃取劑，發(fā)酵濾液用去離子水稀釋2倍，分別與等體積的萃取劑混合，120 r/min室溫振蕩1 h，混合液轉移至分液漏斗，靜置過夜分層，分別收集萃取相和萃余相，以油菜菌核病菌為指示菌，以未經萃取的發(fā)酵液為對照，參照1.3中的方法檢測其抑菌活性。

1.8 數據處理

測序獲得菌株的16S rDNA序列，通過互聯網，將序列提交NCBI數據庫，應用Blast程序與數據庫中已知放線菌的16S rDNA序列進行相似性比較。采用MEGA4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 放線菌株的分離和拮抗活性測定

從懷化通道縣萬佛山采集的土樣中分離、純化得到216個放線菌菌落，以油菜菌核病菌為指示菌，篩選出4株具有拮抗作用的放線菌，其中以菌株HPS02的拮抗效果最好(圖1)，該菌株的5倍發(fā)酵稀釋液對油菜菌核病菌菌絲生長抑制率高達91.04%。

圖1 菌株HPS02對油菜菌核病菌的拮抗作用

2.2 放線菌菌株HPS02的分類鑒定

2.2.1 菌株HPS02的形態(tài)特征

在高氏一號培養(yǎng)基上生長，HPS02菌株的基內菌絲和氣生菌絲均很豐富，在掃描電鏡下觀察(圖2)發(fā)現氣生菌絲體形成孢子鏈時，孢子絲呈直線狀，孢子呈扁圓柱形。

圖2 菌株HPS02的孢子形態(tài)

2.2.2 生理生化特性

HPS02菌株在高氏一號固體培養(yǎng)基中生長產生淡黃色色素。能使明膠液化，能使牛奶胨化，不能分解利用纖維素，不能使淀粉水解，在柴納斯培養(yǎng)基上能產生硫化氫。

2.2.3 菌株HPS02的分子生物學鑒定

菌株HPS02的16S rDNA 序列經測定全長為1 458 bp，Blast分析(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 表明，HPS02與Streptomycesaburaviensis的相似性最高，為99%。

將菌株的16S rDNA序列與BLAST搜索到的相近菌株進行比較分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結果表明，HPS02菌株與S.purpureus及S.aburaviensis的16S rDNA序列相似性均達到99%。結合形態(tài)學、培養(yǎng)特征和生理生化特征分析，S.purpureus的孢子絲有4～8圈螺旋，并產生藍色色素，而HPS02菌株的孢子絲直立，產生淡黃色色素，與S.aburaviensis特征一致，因此，將其鑒定為S.aburaviensis。

圖3 HPS02菌株16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 抗菌譜試驗結果

用該菌株的無菌發(fā)酵濾液進行抗菌譜試驗，結果表明，該菌株對供試的6種植物病原真菌和5種病原細菌均有抑制作用，對病原真菌菌絲生長抑制率為37.8%～60.3%(表1)，對病原細菌的抑制作用為4～10 mm。其中，對稻瘟病菌、小麥赤霉病菌的抑菌效果較好，抑制率分別為60.3%、59.1%。對水稻白葉枯病菌的抑菌圈直徑達到10.6 mm。在5%和1%水平上抑菌效果顯著高于其他病原菌。

表1放線菌HPS02菌株發(fā)酵液對病原真菌的抑菌作用1)

Table1InhibitionoffermentationbrothofstrainHPS02againstthefungalphytopathogens

病原真菌Fungus抑菌率/%Inhibitionrate辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici(37．8±0．60)dD黃瓜疫霉病菌Phytophthoramelonis(45．4±0．57)cC黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum(50．6±0．57)bB草莓灰霉病菌Botrytiscinerea(56．3±0．55)aA小麥赤霉病菌Gibberellazeae(59．1±1．01)aA稻瘟病菌Magnaportheoryzae(60．3±0．64)aA

1) 樣品的濃度為5倍稀釋發(fā)酵液;數據是3次重復的平均值。
The concentration of samples was the fermentation broth diluted by 5 times;the data were the mean of three replicates.

2.4 放線菌HPS02發(fā)酵液的穩(wěn)定性

2.4.1 熱穩(wěn)定性

放線菌株HPS02發(fā)酵液熱穩(wěn)定性較差。與原發(fā)酵液相比，在60 ℃以下處理1 h后，抑制率沒有很大下降。但隨著溫度的升高，對油菜菌核病菌的抑制率開始出現明顯下降，在100 ℃處理1 h后，抑制率為10.41%，與原發(fā)酵液91.04%相比，下降了88.56%(圖4)，說明菌株HPS02發(fā)酵液不耐高溫。

圖4 不同溫度對HPS02發(fā)酵液抗菌活性的影響

表2 放線菌HPS02菌株發(fā)酵液對5種病原細菌的抑制作用1)

1) 小寫字母與大寫字母分別代表差異顯著性水平為5%和1%。
The lowercase and capital letters indicate the significance levels of difference at 5% and 1%，respectively.

2.4.2 酸堿穩(wěn)定性

菌株HPS02發(fā)酵液在酸性和堿性條件下比較穩(wěn)定。分別用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調原發(fā)酵液pH至4和10，處理2 h后，調至原發(fā)酵液的pH，對油菜菌核病菌的抑制率分別為85.07%和83.58%，與原發(fā)酵液91.04%相比，下降不明顯(圖5)。但在發(fā)酵液活性物質分離純化和使用過程中應盡量保持pH 5～7的條件。

圖5 不同pH對HPS02發(fā)酵液抗菌活性的影響

2.4.3 紫外穩(wěn)定性

菌株發(fā)酵液在距20 W紫外燈10 cm處照射1、3、5、7、9、12 h后，與原發(fā)酵液相比較，幾乎完全喪失了生物活性，說明菌株HPS02發(fā)酵液中抗菌物質對紫外線很敏感。

2.5 抗菌物質提取結果

隨著硫酸銨飽和度的提高，沉淀物質對油菜菌核病菌的菌絲生長抑制率逐漸增大，硫酸銨飽和度為40% 時，沉淀物質的抑菌率達76.4%；硫酸銨飽和度為60%時，其抑菌率達90.8%，而60%以上時抑菌活性基本不變。而且，發(fā)酵液經4種極性不同的有機試劑萃取后，萃余相的抑菌活性與原發(fā)酵液的抑菌活性相差很小，表明菌株HPS02發(fā)酵液的活性物質不易溶入有機溶劑，易溶于水。

3 結論與討論

從懷化通道縣萬佛山采集的土樣中，分離篩選得到一株對油菜菌核病菌有強拮抗活性的放線菌菌株HPS02，稀釋5倍發(fā)酵液對該病菌的菌絲生長抑制率達91.04%。結合菌株培養(yǎng)特征、形態(tài)學觀察、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，將HPS02菌株鑒定為阿布拉鏈霉菌(S.aburaviensis)。HPS02菌株對多種植物病原菌均有抑菌活性。

放線菌是一類重要的生防資源，其代謝產物已成為新農藥研發(fā)的主體之一[18]。阿布拉鏈霉菌(S.aburaviensis)產生多種抗生素。如William等在1988年12月對S.aburaviensis菌株C-38,242(ATCC39290)產生的新型復合物jildamycin和mantuamycin申請了專利。該兩種化合物表現出抗腫瘤活性[19]。Raytapadar等[20]報道，從印度分離得到一個S.aburaviensis菌株1DA-28，產生抗細菌抗生素。Jignasha等從印度西部沙漠土樣中分離到一株S.aburaviensisKut-8，對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌等革蘭氏陽性菌有較好的拮抗活性[18]。未見該鏈霉菌產生抗真菌蛋白的報道。

此外，油菜菌核病防治的關鍵是提高植株的抗病性。傳統(tǒng)抗病品種選育不僅費時而且復雜，而運用現代分子生物學技術進行抗病育種可加速選育進程。本研究發(fā)現的放線菌株HPS02對油菜菌核病菌有強拮抗活性，對菌絲生長抑制率達到91.04%，抑菌的主要活性成分可能為蛋白質，表明該菌株中可能含有抗菌核病的基因。若能將抗病基因克隆出來并轉入油菜植株，將從根本上提高油菜抗菌核病的能力，從而為進一步高效安全地控制油菜菌核病提供新途徑。

目前, 課題組已經開始分離純化HPS02菌株發(fā)酵液中抗菌蛋白。而對抗菌蛋白的結構鑒定及其抗病基因的克隆等有待進一步研究。

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Isolation,identificationandthemetabolitesofantagonisticstrainHPS02againstSclerotiniasclerotiorum

He Chao1,2， Zhou Xinyu1,2， Huang Jun3， Liu Shuangqing1,2， Zhu Hongjian1,2

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.HunanProvincialKeyLaboratoryforBiologyandControlofPlantDiseasesandInsectPests,Changsha410128,China; 3.HunanProvinceMicrobiologyInstitute，Changsha410009,China)

The biocontrol resources ofSclerotiniasclerotiorumwere explored in this study to control the spread of this disease in oilseed rape. Four antagonistic actinomycetes againstS.sclerotiorumwere isolated from the soil samples collected from Huaihua City, Hunan Province. Among them, strain HPS02 had the highest antagonistic activity againstS.sclerotiorumwith an inhibition rate of 91.04%. This strain was identified asStreptomycesaburaviensisaccording to the characteristics of culture, morphology, physiological and biochemical identification and sequence analysis of 16S rDNA.Antimicrobial spectrum study showed that this strain possessed antagonism against a variety of plant pathogens. In addition, the fermentation broth of strain HPS02 was stable to pH value, but it was sensitive to temperature and UV. The antagonistic activity of the precipitate from fermentation broth with (NH4)2SO4was consistent with the fermentation broth. And after extraction by four different organic reagents, the antagonistic activity of extraction raffinate was almost the same as that of the original broth. The results provide scientific evidence for the biocontrol of the rape sclerotinia rot.

Sclerotiniasclerotiorum； actinomycetes； fermentation broth； stability; antagonism

2013-09-02

：2014-02-06

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201103016)；中國博士后科學基金(2013M542114);湖南省高?？萍紕?chuàng)新平臺建設經費(12K062); 湖南省科技計劃項目(2013FJ3012)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.04.006

* 通信作者 E-mail: hongjian62@163.com