傅淑平， 楊 麗， 洪 浩， 偶 晨， 張榮華△

(1南京中醫(yī)藥大學針藥結合省部共建教育部重點實驗室，江蘇 南京 210023;2暨南大學藥學院中藥教研室, 廣東 廣州 510632)

梓醇(catalpol)是從玄參科植物地黃中分離出來的單一有效化學成份之一，也是中國藥典指定的地黃定性指標，屬于環(huán)烯醚萜類化合物[1]。我們的前期研究顯示，0.05～10 mg/L梓醇培養(yǎng)液對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖均有促進作用，其中1.0 mg/L梓醇培養(yǎng)液對細胞的增殖作用最強，但其具體作用機制并不明確[2]。近期研究表明，Wnt信號通路在BMSCs自我更新過程中具有重要的調節(jié)作用[3], 但其是否與梓醇的促干細胞增殖作用有關，尚不清楚。本研究主要在前期工作基礎上，檢測梓醇對BMSCs細胞周期的影響，同時觀察Wnt信號通路中相關因子在此過程中的變化情況，探討梓醇促BMSCs增殖的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級(SPF)3月齡SD雌性大鼠(體重約200 g)，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證號為0004482)。

2 藥物

梓醇標準品購買于北京世紀奧科生物技術有限公司，結構式見圖1，純度經HPLC檢測均大于98%，稱取梓醇1 mg，溶解于10 mL低糖DMEM完全培養(yǎng)液中，0.22μm過濾分裝，配制成為100 mg/L母液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Figure 1. The chemical structure of catalpol.

3 主要試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)，胰酶(Amresco)，EDTA和RNase A (Sigma)，碘化丙啶和Trizol (Invitrogen)，RT-PCR Kit(TaKaRa)，β-catenin抗體(Cell Signaling Technology)，ECL化學發(fā)光試劑盒(Pierce)。

4 方法

4.1梓醇對BMSCs細胞周期的影響 取生長良好的第3代BMSCs以5×107cells/L密度接種在培養(yǎng)瓶中，將細胞分為空白對照組與梓醇處理組，待細胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，換成無血清培養(yǎng)基，24 h細胞周期同步化后，各組分別加入DMEM培養(yǎng)液及1.0 mg / L梓醇培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，6 d后，待細胞匯合至90%左右，消化細胞，PBS洗2次，1 200 r/min離心4 min，制成單細胞懸液，移入離心管。加入預冷的70%無水乙醇2 mL快速混勻，固定細胞24 h，去除乙醇，用0.1 mol/L PBS洗滌2次，每次加洗液2.5 mL左右，1 200 r/min離心4 min，調整細胞濃度為1×109cells/L。加200 μL RNaseA (1 g/L)，37 ℃水浴30 min，立即放入冰浴中，再加PI染色液(50 mg/L)，避光反應30 min，F(xiàn)ACScan流式細胞儀檢測分析細胞周期。以增殖指數(proliferation index，PI)表示細胞增殖活性，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

4.2梓醇對Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表達的影響 取生長良好的細胞，以1×108cells/L密度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞周期同步化后，按2.1所述進行分組并培養(yǎng)6 d，細胞匯合至90%以上時，消化各組細胞，提取細胞總RNA，采用real-time PCR技術檢測各組細胞中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin及GAPDH表達情況，引物序列見表1。參照大連寶生物有限公司的TaKaRa SYBRR ExScriptTMRT-PCR Kit說明書合成第1鏈cDNA，反應體系10 μL(冰上操作)，上述反應液混勻后于PCR擴增儀上42 ℃反應15 min，95 ℃反應2 min。隨后取2 μL cDNA樣本按照10倍梯度稀釋成4～6個濃度梯度的cDNA，并以此構建目的基因及看家基因的標準曲線。利用梯度樣本cDNA的Ct值作為橫坐標，樣本的起始拷貝數的對數作為縱坐標，分別建立目的基因和看家基因的標準曲線，并設置2～4個不加模板cDNA(以滅菌蒸餾水代替)的PCR管作為空白對照管。在相同條件下檢測樣本目的基因和看家基因的Ct值，利用標準曲線計算該樣本的目的基因和看家基因的起始拷貝數。反應結束后，由電腦自動生成熒光擴增曲線、標準曲線以及熔解曲線。使用最大二階倒數法進行分析。

表1 引物序列

4.3梓醇對β-catenin mRNA 及蛋白表達的影響 實驗分組及培養(yǎng)方法同2.1，細胞培養(yǎng)6 d后，消化各組細胞，根據Trizol試劑使用說明同時提取細胞總RNA及總蛋白，檢測各實驗組β-catenin mRNA及蛋白表達情況。其中β-catenin mRNA表達情況按2.2所述方法進行檢測，引物序列見表1。β-catenin蛋白表達利用Western blotting技術進行檢測，GAPDH蛋白作為內參對各組數據進行均一化。具體操作如下：取20 μg總蛋白變性后，進行SDS-PAGE垂直電泳，30 mA，2 h；隨后將蛋白轉到PVDF膜上，250 mA，2 h；將膜取出放入含5%脫脂奶粉的TBS/T封閉液中封閉1 h，然后分別放入Ⅰ抗β-catenin(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)中孵育，4 ℃過夜；經TBS/T清洗后，再加入Ⅱ抗常溫反應2 h，隨后加入ECL化學發(fā)光試劑，利用化學發(fā)光儀檢測目的條帶，并用ImageJ圖像分析軟件對各組條帶進行分析。

5 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 18.0軟件處理，采用t檢驗進行統(tǒng)計分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 梓醇對BMSCs細胞周期的影響

從圖2及表2可知，空白對照組BMSCs有(8.90±0.46)%的細胞處于S和G2/M期，經藥物干預后，梓醇處理組有(17.93±1.68)%的細胞處于S和G2/M期，梓醇處理組PI值高于空白對照組(P<0.01)。

Figure 2. The effect of catalpol on cell cycle of BMSCs. A: control group; B: catalpol group.

表2 各實驗組BMSCs增殖指數

2 梓醇對Wnt3a、Wnt5a及Wnt11 mRNA表達的影響

如圖3所示，不同Wnt蛋白在BMSCs的mRNA表達水平不盡相同，Wnt3a表達水平較低，而Wnt5a表達水平明顯高于Wnt3a與Wnt11。與空白對照組相比較，梓醇干預后，Wnt5a mRNA表達水平提高了11.73倍,Wnt11 mRNA表達水平提高了7.18倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);但Wnt3a mRNA表達水平并無明顯改變。

3 梓醇對β-catenin mRNA及蛋白表達的影響

與空白對照組相比較，梓醇干預后，β-catenin/GAPDH mRNA相對表達量由0.79增加到1.04，其表達水平提高了1.3倍, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4A。除此之外，Western blotting結果顯示，梓醇可明顯提高BMSCs內β-catenin蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4B。

Figure 3. The effect of catalpol on the mRNA expression of Wnt3a, Wnt5a and Wnt11 in BMSCs.Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The effect of catalpol on the mRNA (A) and protein (B) expression of β-catenin.Mean±SD.n=6. **P<0.01 vs control.

討 論

細胞周期與細胞增殖的關系非常密切，通常情況下大部分的BMSCs處于靜息期，但是一旦進入了細胞周期，G1和G2期明顯縮短，細胞在體外就會出現(xiàn)高速率的擴增；且細胞進入不同的細胞周期階段時，細胞中DNA會隨著細胞周期的各期而發(fā)生變化，因此當細胞受到某些因素刺激，可使DNA 含量發(fā)生變化，從而引起細胞周期發(fā)生改變[4]。細胞增殖指數則是指S期與G2/M期DNA含量之和與S期、G2/M及G0/G1期DNA含量之和的比，它是反映細胞增殖的重要指標之一。本研究在前期證實梓醇對BMSCs增殖有促進作用后，進一步觀察其對細胞周期的影響，結果表明BMSCs在未作處理時，大部分細胞處于相對不活躍的靜止期即G0/G1期，PI值約為8.90%，與文獻報道BMSCs的PI值在10%左右相一致[5]；而經過梓醇干預后，所培養(yǎng)的BMSCs S期與G2/M期DNA含量增加到17.93%，提示梓醇可通過促進大鼠BMSCs進入細胞周期，增加其增殖指數，從而達到促進細胞增殖的作用。

Wnts是一種富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，Wnt信號通路參與多種細胞過程的調節(jié)，如細胞生長、分化、功能及死亡；Wnt信號通路可分為經典Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路。經典Wnt信號通路又稱為Wnt/β-catenin信號通路，主要是激活核內靶基因的表達；當無Wnt信號時，胞內游離的β-catenin與APC、Axin、GSK-3β結合，形成“降解復合物”，GSK-3β使β-catenin磷酸化，被SCF復合物識別，分解其多肽鏈，從而水解，無法進入核內發(fā)揮作用；而當有Wnt信號如Wnt3a、Wnt1、Wnt8、Wnt10b等存在情況下，Wnt蛋白與其受體Frizzled及LRP6結合，并激活其下游瀑布級聯(lián)反應，抑制β-catenin降解，使β-catenin在胞內穩(wěn)定的積累，并促使其進入核內激活下游靶基因的轉錄。一些不產生β-catenin積累信號的Wnt，包括Wnt5a、Wnt11在內的多種Wnt蛋白則通過其它方式轉導信號，稱為非經典Wnt信號[6-8]。研究表明，Wnt信號通路可以促進某些細胞如造血干細胞[9]、神經干細胞[10]、腫瘤細胞等[11]的自我更新和增殖。從多孔鈣支架中釋放出來的Wnt3a可以使移植的hMSCs獲得有絲分裂原的刺激，增加β-catenin穩(wěn)定性，對MSCs增殖與存活具有促進作用[12]。在未分化的MSCs擴增期間，予以Wnt3a干預，可以出現(xiàn)細胞數目增加，細胞增殖加速及細胞凋亡下降的結果[13]。通過抑制GSK-3β活性，增加β-catenin在胞內的積累，可有效抑制細胞凋亡[14]。另有研究表明，除了Wnt3a、Wnt1介導的經典Wnt信號可能增加β-catenin在胞內的蓄積、促進細胞增殖與存活外，Wnt5a所介導的非經典的Wnt信號通路亦可抑制未分化雙能C2C12細胞、成骨細胞前體細胞及骨髓來源的OB-6成骨細胞因血清饑餓所誘導的細胞凋亡，同時還可以促進這些細胞的增殖、募集和分化，以增加細胞的存活時間[15]。由此我們也可以看出，Wnt信號的經典與非經典通路均參與了MSCs的增殖過程。為探討梓醇促BMSCs增殖作用與Wnt信號通路的活化是否存在相關性。本實驗通過運用real-time PCR和Western blotting技術分別檢測了各實驗組中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11、β-catenin mRNA表達及β-catenin蛋白含量變化情況，結果顯示：經梓醇干預后，BMSCs中Wnt5a、Wnt11及β-catenin mRNA表達均明顯升高，Wnt3a表達量無變化；但β-catenin蛋白合成明顯高于空白組，說明梓醇雖然沒有表現(xiàn)出對Wnt3a mRNA表達的增強作用，但其明顯增加了β-catenin mRNA的表達量和β-catenin蛋白合成量，說明梓醇可能通過調節(jié)其它Wnt蛋白，比如Wnt1、Wnt7a等，促進胞內β-catenin的累積，激活經典Wnt信號，從而促進BMSCs增殖；另外，細胞內Wnt5a和Wnt11 mRNA表達在梓醇干預下亦明顯上升，而且其提高的幅度遠遠高于β-catenin mRNA，提示非經典Wnt信號通路的活化也可能參與了梓醇促BMSCs增殖的過程。

綜上所述，我們認為梓醇可能通過Wnt3a以外的Wnt蛋白激活的經典Wnt信號通路和由Wnt5a、Wnt11激活的非經典Wnt信號通路促使BMSCs進入細胞周期，達到促進細胞增殖的作用。但具體哪一種Wnt蛋白是梓醇促BMSCs增殖過程中Wnt經典信號通路激活的啟動點？Wnt5a和Wnt11激活了哪一條非經典Wnt信號通路？經典與非經典Wnt信號通路在這一過程中的具體地位孰輕孰重？尚有待于更為深入的研究。

[參 考 文 獻]

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