邱紅+胡筱梅

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北十堰442008）

[摘要]目的：建立測定柴枳四逆散中辛弗林含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜條件為Fortis C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（43：57），流速為1.0ml·min-1，柱溫：30℃，檢測波長為275nm。結(jié)果：辛弗林在1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為98.0%，RSD 為1.50%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于柴枳四逆散中辛弗林的測定。

[關(guān)鍵詞]辛弗林；柴枳四逆散；離子對(duì)高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-5200（2014）04-069-03

DOI：10.11876/mimt201404022

Determination of synephrine in Caizhi Sini Powder by Ion-Pair HPLCQIU Hong，HU Xiao-mei.（Department of clinical laboratory, Affiliated Dongfeng Hospital, Hubei Medical University, Hubei Shiyan 442008, China）

[Abstract]Objective：To establish a method for the determination of synephrine in Caizhi Sini Powder. Method：The RP-HPLC system consisting the Fortis C18（4.6×250mm, 5μm）column, the mobile phase consisted of MeOH –KH2PO4 (43: 57), the flow rate was 1.0ml·min-1, the column temperature was 30℃,The UV detector was set at 275nm. Results：The linear response range was 1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）.The average recovery of schisandrin was 98.0%, RSD was 1.50%. Conclusions：The assay demonstrated that the method was simple and accurate, repeatable, it can be applied in determination of schisandrin in synephrine in Caizhi Sini Powder.

[Key words]synephrine；Caizhi Sini Powder；Ion-Pair-HPLC柴枳四逆散為原國家衛(wèi)生部部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)收載中藥成方制劑[1]，以柴胡、枳實(shí)、白芍、甘草4味中藥所組成。具有疏肝理脾之功效。主要用于熱厥手足不溫，胸脅痞滿，下痢腰痛等癥候。枳實(shí)為方中君藥性苦；辛；寒。歸脾；胃；肝；心經(jīng)。具有，消痰癖，祛停水，逐宿食，破結(jié)胸，通便閉之功效。主要用于積滯內(nèi)停；痞滿脹痛；大便秘結(jié)；瀉痢后重；結(jié)胸等病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳實(shí)含有豐富的黃酮類、維生素、有機(jī)酸、類黃酮等成分[2]。枳實(shí)提取物、枳實(shí)注射液及其有效成分對(duì)羥福林（辛弗林）有強(qiáng)心、增加心輸出量、收縮血管、提高總外周阻力，而使左室壓力和動(dòng)脈血壓上升的作用[3]。辛弗林除具有升壓、抗休克作用外，還具有提高新陳代謝、增加熱量消耗、提高能量水平、氧化脂肪、減肥作用[4]。

本方原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無含量測定項(xiàng)，為更確切研究本方劑的藥理作用與枳實(shí)用量的關(guān)系，本研究建立了高效液相色譜法測定方中主藥枳實(shí)的活性成分辛弗林的含量，現(xiàn)將具體方法報(bào)道如下。

1儀器與試藥

Dionex-U3000液相色譜儀（德國Dionex公司，U3000 二極管陣列檢測器，Dionex Chemeleon色譜工作站），SK5200H超聲波清洗機(jī)（超聲儀器有限公司）；梅特勒MS105DU型電子天平（d=0.01mg）；辛弗林（1110727 - 20 0306，供含量測定用，由中國食品藥品檢定研究院提供，純度≥98.5%），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。柴枳四逆散及陰性空白制劑（自制，規(guī)格：10g/袋）。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

使用電子分析天平，精密稱定經(jīng)真空干燥減壓器中減壓恒重干燥的辛弗林適量，加水制成每1ml含36.4μg的溶液。

2.2供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

精密稱定本品2.0g，置錐形瓶中，密塞，精密加入50mL甲醇，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，通過聚酰胺柱（60～90目，2.5g，內(nèi)徑為1.5cm，干法裝柱），用水25mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3色譜條件

色譜柱： Fortis C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6g，十二烷基磺酸鈉1.0g，冰醋酸1mL，加水溶解并稀釋至1000mL）（43：57）[5-9]；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：275nm；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，辛弗林理論塔板數(shù)不小于3000，色譜圖見圖1。柴枳四逆散中其他成分對(duì)辛弗林的含量測定無影響。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

吸取辛弗林溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混合均勻，辛弗林濃度分別為1.82、3.64、7.28、18.20、29.12、36.40μg·mL-1，分別進(jìn)樣10μL，按以上色譜條件進(jìn)行分析，以辛弗林色譜峰面積（Y）對(duì)辛弗林對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果： Y=1.2596X-0.0457，r=0.9999，線性范圍為1.82～36.40μg·mL-1。

2.5精密度試驗(yàn)

照“2.3”項(xiàng)下條件準(zhǔn)備色譜分析，連續(xù)測試同一辛弗林對(duì)照品溶液6次，記錄辛弗林色譜峰面積，結(jié)果顯示辛弗林相對(duì)保留時(shí)間一致，辛弗林色譜峰面積的RSD為1.16%，說明實(shí)驗(yàn)精密度好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批柴枳四逆散，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供穩(wěn)定性測試的供試品溶液，室溫下取該供試品溶液分別在0，2，4，8，12、24h分析測定，計(jì)算辛弗林色譜峰面積RSD為1.48%，結(jié)果說明處理后的柴枳四逆散供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

稱取柴枳四逆散（批號(hào)20110508）6份，按“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供重復(fù)性測試的供試品溶液，每份柴枳四逆散制備2個(gè)供試品溶液，每個(gè)供試品溶液連續(xù)測定兩次，記錄辛弗林色譜峰面積，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算辛弗林在柴枳四逆散中的含量，并將所得含量結(jié)果計(jì)算平均含量為1.02mg·g-1，RSD為1.58%。顯示本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好。

endprint

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2樣品測定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問題。采取預(yù)先過篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十二冊(cè)[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新編中藥志 (二卷) [M]. 2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：459- 460.

[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對(duì)小鼠胃排空、小腸推進(jìn)功能的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]國家藥典委員會(huì).《中國藥典》（一部）[S]. 中國醫(yī)藥科技出版社，2010，230．

[6]趙宇, 謝培山, 盧平華, 等. 枳實(shí)、 枳殼、 青皮和陳皮等藥材中辛弗林含量測定研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC測定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2樣品測定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問題。采取預(yù)先過篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十二冊(cè)[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新編中藥志 (二卷) [M]. 2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：459- 460.

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[6]趙宇, 謝培山, 盧平華, 等. 枳實(shí)、 枳殼、 青皮和陳皮等藥材中辛弗林含量測定研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC測定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2樣品測定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問題。采取預(yù)先過篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十二冊(cè)[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新編中藥志 (二卷) [M]. 2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：459- 460.

[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對(duì)小鼠胃排空、小腸推進(jìn)功能的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]國家藥典委員會(huì).《中國藥典》（一部）[S]. 中國醫(yī)藥科技出版社，2010，230．

[6]趙宇, 謝培山, 盧平華, 等. 枳實(shí)、 枳殼、 青皮和陳皮等藥材中辛弗林含量測定研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC測定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛玲，王嘉林. HPLC法測定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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