崔 翠，王利鵑，周清元，譚尊飛，曲存民，張正圣

(西南大學, 農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400715)

低溫脅迫下烤煙幼苗葉片光合作用和抗氧化能力基因差異表達譜

崔 翠*，王利鵑，周清元，譚尊飛，曲存民，張正圣

(西南大學, 農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400715)

對低溫(5—7 ℃)脅迫下烤煙“K326”幼苗葉片光合指標、膜氧化水平及其抗氧化指標進行測定，并利用數(shù)字化基因表達譜技術(shù)進行基因差異表達分析。低溫脅迫后烤煙幼苗葉綠素含量、光合能力顯著下降，脯氨酸含量、丙二醛含量上升，超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、抗壞血酸含量和谷胱甘肽含量均顯著上升。低溫脅迫后有2357個基因發(fā)生了顯著差異表達，其中1673個基因表達上調(diào)、684個基因表達下調(diào)，其分子功能、細胞位置和主要代謝過程均涉及光系統(tǒng)、膜氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)。對涉及到的代謝過程進行分析，結(jié)果表明:光合天線蛋白調(diào)控基因表達量均顯著下降、光合作用的主要調(diào)控基因表達量多數(shù)表現(xiàn)為顯著下調(diào)、而與氧化能力相關(guān)的谷胱甘肽代謝差異表達基因大多數(shù)顯著上調(diào)?；虿町惐磉_譜分析結(jié)果和低溫脅迫后葉片光合能力、抗氧化能力生理生態(tài)指標測定結(jié)果基本一致，為進一步研究低溫脅迫對作物的生態(tài)影響和研究基因克隆與功能提供基礎(chǔ)。

烤煙；低溫脅迫；數(shù)字化基因表達譜；抗氧化能力

低溫冷害是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因子之一。低溫會使葉綠素分解，細胞受到傷害，質(zhì)膜相對透性增大[1]，葉綠素含量降低[1- 4]。葉綠體是低溫脅迫的直接目標[5]，低溫削弱植物通過光合作用利用光能的能力[6- 8]。植物在一定低溫范圍內(nèi)通過提高保護酶含量來維持體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除間的動態(tài)平衡。若低溫脅迫嚴重，就會導致自由基含量增高，造成膜脂過氧化，丙二醛含量上升，細胞膜系統(tǒng)受到傷害[9]。溫度逆境也誘導植物本身具有的抗氧化物質(zhì)，如過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽及抗壞血酸等含量上升來抵御逆境傷害[1,10]。

生物對各種生物、理化及致病因子的應答，本質(zhì)上都是基因差異表達的結(jié)果。比較同一類細胞或不同類細胞在不同生理狀態(tài)或生長發(fā)育階段下的基因表達差異，對研究生物生長發(fā)育調(diào)控及代謝機制具有重要意義[11]。近年來，利用mRNA 差異顯示技術(shù)和基因芯片技術(shù)等研究逆境對作物生長發(fā)育的影響取得了重要進展，對作物逆境生理和遺傳育種研究發(fā)揮了積極作用[12- 16]。高通量測序的數(shù)字化基因表達譜(Digital gene expression profile, DGE)技術(shù)是新發(fā)展起來的分析生物轉(zhuǎn)錄組基因表達的方法, 能更加真實、全面地評價細胞中全部基因的表達情況，也能夠檢測未知基因的表達,是發(fā)現(xiàn)新基因的一種有效方法[17- 18]。在轉(zhuǎn)錄水平上對外界非生物脅迫下植物應答機制的研究主要集中在擬南芥、水稻等植物上，脅迫類型以干旱、冷害、鹽脅迫等為主[19- 23]。關(guān)于煙草在低溫脅迫下基因的特異表達研究較少，本研究模擬南方煙區(qū)“倒春寒”，研究低溫脅迫對烤煙幼苗光合能力、膜氧化及抗氧化能力的影響，再通過高通量的數(shù)字化基因表達譜技術(shù)，分析低溫脅迫下烤煙幼苗抗寒相關(guān)基因的差異表達譜，尋找低溫脅迫后與煙草光合作用、抗氧化能力有關(guān)的功能基因，為深入分析煙草低溫脅迫傷害機理、挖掘抗寒相關(guān)基因，提高煙草適應性栽培等方面提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

試驗材料為生產(chǎn)上大面積栽培的Msk326(K326)，由云南煙草科學研究所選育。選取大小一致且飽滿的烤煙種子浸種催芽出苗后，分別移栽于裝有營養(yǎng)土的塑料缽內(nèi)，在3葉期選取大小基本一致煙苗，每缽定苗3株，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長。培養(yǎng)條件：溫度為23—25 ℃；光照強度為6000 lx，每日光照12 h。煙苗長至5—6片真葉時，5—7 ℃低溫脅迫處理3 d(標記為B)，常溫23—25 ℃培養(yǎng)為對照(標記為A)。取其相同部位葉片進行RNA提取和相關(guān)生理指標測定。

總RNA提取試劑盒為WASON(RNAex Reagent System Ⅳ)試劑盒，上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)，其它均采用國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理生化指標測定

取處理(B)和對照(A)葉片，參考崔翠方法[24]，分別測定總?cè)~綠素Chl 含量，Chl a 及Chl b含量，Pn，Gs，Tr，Ci，電解質(zhì)滲透率，Pro及MDA含量，POD、CAT和SOD活性，GSH及Vc含量等生理指標。每處理4次重復，測定數(shù)據(jù)利用Micorsoft excel 軟件進行處理，利用DPS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性檢驗。

1.2.2 低溫脅迫后烤煙幼苗葉片基因差異表達譜的分析

RNA提取方法參考試劑盒操作手冊進行，分別取對照(A)和處理(B)葉片混合成兩個樣品池，從兩個樣品池中各取混合煙葉葉片組織0.5 g左右，提取6 μg總RNA，-78 ℃保存。測序由深圳華大基因科技有限公司承擔。采用邊合成邊測序法(Sequencing by synthesis，SBS)測序[25]。測序所得原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling 轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。對測序得到的原始標簽去除3′adaptor 序列、低質(zhì)量序列(含未知堿基)以及長度過小或過大，拷貝數(shù)為1的tag，確定Clean tag。對初步篩選獲得的Clean tags進行標準化處理[26]，統(tǒng)計不同tag的分布特征，分析測序飽和度。將Clean tags 與基因序列進行比對，確定Clean tag 代表的基因。通過tags 統(tǒng)計相應基因的表達量。

從NCBI網(wǎng)站檢索mRNA Unigene序列上所有CATG位點，生成CATG+17堿基的參考標簽數(shù)據(jù)庫。將全部clean tags與參考標簽數(shù)據(jù)庫比對，允許最多1個堿基錯配，對其中唯一比對到1個基因的標簽(Unambiguous tags)進行基因注釋，統(tǒng)計每個基因?qū)脑嫉腸lean tag數(shù)目，然后對原始clean tag數(shù)做標準化處理，獲得標準化的基因表達量，衡量基因的表達水平。標準化的方法為：每個基因包含的原始clean tag 數(shù)/該樣本中總clean tag 數(shù)×1000000[26]。參照Audic S.等發(fā)表在Genome Research上的數(shù)字化基因表達譜差異基因檢測方法[17]。

參考李余良等方法[15]把所有差異表達基因向GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(http：//www.genetntology.org/)的各個項目映射，找出與整個Tag庫背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目和顯著性富集的Pathway，分析其中與光合及抗氧化能力相關(guān)的差異表達基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫處理對烤煙幼苗葉片部分光合能力和抗氧化指標的影響

葉綠素與光合作用密切相關(guān)，同時也是衡量植物抗寒力高低的一項重要指標。結(jié)果如表1所示，低溫處理3 d后的葉綠素含量，無論是葉綠素a (Chl a)還是葉綠素b (Chl b)含量均顯著下降，說明低溫脅迫嚴重阻礙了葉綠素合成；低溫處理后烤煙葉片光合能力降低，低溫導致凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率顯著下降。氧自由基的積累對細胞存在著巨大傷害，處理3 d后烤煙幼苗葉片電解質(zhì)滲透率、脯氨酸含量及丙二醛含量均顯著上升，說明低溫脅迫已對烤煙幼苗葉片細胞膜造成一定傷害，但其氧自由基生成速率(形成速率)顯著下降；另外，膜保護酶中CAT及SOD活性顯著上升，而POD活性則顯著下降；抗氧化物質(zhì)Vc和GSH含量均顯著上升。從結(jié)果來看，低溫脅迫3 d后，K326幼苗葉片光合能力下降，細胞膜氧化，但其自身抗氧化能力顯著提升。低溫處理3d后烤煙K326幼苗在光合能力、膜氧化及抗氧化能力方面均發(fā)生顯著變化。

表1 低溫脅迫后烤煙幼苗葉片部分生理指標

*表示差異顯著(P<0.05)

2.2 基因差異表達譜分析

2.2.1 RNA質(zhì)量檢測和測序質(zhì)量評估

分別提取低溫脅迫(B)及常溫培養(yǎng)(A)的烤煙幼苗葉片的總RNA，樣品經(jīng)NANODrop 2000C 核酸檢測儀檢測，OD260/OD280均在1.8—2.2范圍內(nèi)，純度較高。按照檢測的濃度，將相同處理的總RNA等量混合。用DNase I降解基因組DNA，電泳顯示RNA均保持完整性?？俁NA用電泳檢測表明，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰可見，無拖帶現(xiàn)象，說明RNA完整性較好，可滿足實驗要求。

測序得到對照樣品A 和處理樣品B 原始序列數(shù)據(jù)，經(jīng)去除雜質(zhì)后得到高質(zhì)量tag(Clean tag)分別有3490430條和3506495條，占總tag數(shù)的95.91%和94.69%；僅有5%左右的tag拷貝數(shù)小于2或只有接頭序列。通過測序分析，最終得到的clean tag的數(shù)量均達到總測序量90%以上，說明樣品制備和測序質(zhì)量良好。對2個樣品Clean tag拷貝數(shù)分布進行分析，顯示拷貝數(shù)大于100的高表達Tags 在對照和處理中分別占63.79%和55.50%，在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢； 拷貝數(shù)小于5的低表達Tags雖然在總拷貝數(shù)中分別只占5.94%和7.24%，但是在種類上非常豐富, 均達到57%以上，從整體上評估測序數(shù)據(jù)正常。

從NCBI網(wǎng)站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載和煙草相關(guān)的參考基因有24432條，參考tag有74261條。通過軟件檢索Unigene上所有CATG位點，生成CATG+17堿基的參考標簽數(shù)據(jù)庫，其中參考基因中有CATG位點的基因有22263個，唯一的參考標簽有72259個。將clean tags分別與參考標簽數(shù)據(jù)庫比對，并統(tǒng)計每個基因?qū)猚lean tag的數(shù)目。對照(A)一個tag完全比對上一個基因的標簽(允許1個堿基錯配)數(shù)目為1066364，占總數(shù)的30.55%，種類為16983種，占總數(shù)的13.47%；而處理(B)一個tag完全比對上一個基因的標簽(允許1個堿基錯配)數(shù)目為889559，占總數(shù)的25.37%，種類為18619，占總數(shù)的12.03%。

2.2.2 低溫脅迫后烤煙幼苗葉片基因表達譜分析

經(jīng)過Unigene標簽庫進行基因注釋后，通過基因比對，設(shè)定FDR≤0.001[25]，且倍數(shù)差異在2倍以上(∣log2ratio∣≥1)作為閾值來分析判斷基因在2個溫度狀態(tài)下是否差異表達，篩選出差異表達基因。低溫脅迫后(處理B)與對照A相比較(圖1)，有2357個基因發(fā)生了顯著的差異表達，其中有1673個基因表達上調(diào)，log2ratio值大于10的有62個，5.00 — 9.99之間的有185個，1.00 — 4.99之間有1426個；684個基因表達下調(diào)，log2ratio值小于 -10的有11個， -9.99— -5.00之間的有51個， -4.99— -1.00之間的有622個。

圖1 低溫脅迫下烤煙幼苗差異表達基因Fig.1 Differentially expressed genes(DEGs)of leaves of tobacco seedling under chilling stress

通過GO功能富集分析(Gene ontology，簡稱GO)，對差異表達顯著的基因進行功能分類注釋(圖2)。圖2結(jié)果表明，從差異表達基因所處的細胞位置來看，低溫脅迫后烤煙幼苗與對照煙苗發(fā)生顯著差異表達的基因主要集中在光合系統(tǒng)(Photosystem)、光合膜(Photosynthetic Membrane)、類囊體(Thylakoid Part)、葉綠體(Chloroplast)、質(zhì)體(Plastid Part)、細胞質(zhì)(Cell Plastid)、細胞膜(Membrane)等位置，其中與細胞質(zhì)有關(guān)基因發(fā)生差異表達最為顯著，有524個基因發(fā)生差異表達，占總差異表達基因的45.1%；與生物膜有關(guān)的差異表達基因達到420個，占總差異表達基因的36.1%；細胞器部分，差異表達基因達到358個，占總差異表達基因的30.8%；此外，質(zhì)體及細胞內(nèi)細胞器部分等位置差異表達基因亦均達到27%以上。從分子功能分析結(jié)果看，低溫脅迫導致烤煙幼苗基因的氧化還原能力、跨膜運輸能力、結(jié)構(gòu)分子活力發(fā)生顯著改變。其中與氧化還原能力相關(guān)基因差異最為顯著，差異表達基因達到196個，占總差異表達基因的16.3%；與跨膜運輸能力相關(guān)的差異表達基因為104個，占總差異表達基因的8.6%；在結(jié)構(gòu)分子活力方面，差異表達基因達到74個，占總差異表達基因的6.1%。發(fā)生顯著差異表達的生物過程主要集中在脅迫響應、代謝物質(zhì)及能源的初始反應、光合及光反應，對激素刺激的細胞響應、激素調(diào)節(jié)的信號途徑等方面。其中脅迫刺激響應的生物過程差異最為顯著，差異表達基因達到426個，占總差異表達基因的36.3%；與溫度脅迫響應相關(guān)差異表達基因為223個，占總差異表達基因的19.0%；與先導代謝物及能源相關(guān)差異表達基因74個，占總差異表達基因的6.3%。因此，從差異基因所處的位置、分子功能和影響的生物過程來看，調(diào)控烤煙幼苗光合作用和抗氧化能力的基因在低溫脅迫后發(fā)生了較大的差異表達，為進一步分析提供了基礎(chǔ)。

2.2.3 低溫脅迫對烤煙幼苗葉片光合能力的影響

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，基于Pathway的分析有助于進一步了解基因的生物學功能。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫[27]，以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，進行Pathway顯著性富集分析，在Qvalue≤0.05時，低溫對光合天線蛋白(捕光色素蛋白復合體，light-harvesting chlorophyll protein complex，簡寫LHC)和光合能力影響差異顯著。參照Kanehisa laboratories的光合作用天線蛋白示意圖3 (a)，標記顯著差異基因于圖3(b)，并將對應的差異表達基因列于表2。從圖3(b)和表2來看，光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ，簡寫PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，簡寫PSⅡ)中部分捕光葉綠素a/b

圖2 低溫脅迫下烤煙幼苗葉片表達基因的功能分類Fig.2 Classification on functional of differentially expressed genes of leaves of tobacco seedling under chilling stress

圖3 KEGG數(shù)據(jù)庫中光合作用-天線蛋白示意圖(a); 低溫脅迫下烤煙幼苗與光合天線蛋白相關(guān)差異表達基因(b)Fig.3 The skechmap of antenna proteins related photosynthesis in KEGG database(a); Differential expression genes related photosynthesis-antenna proteins of tobacco seedling under chilling stress(b)綠色方框代表表達基因下調(diào)

色素天線蛋白(Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhca5、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5)等均在低溫脅迫下發(fā)生顯著下調(diào)。說明低溫脅迫導致烤煙幼苗對光電子的捕獲能力下降。

表2 與光合作用-天線蛋白相關(guān)的差異表達基因相關(guān)信息

參照Kanehisa laboratories的光合作用示意圖4(a)，將差異表達基因分別標記在圖4(b)，并將對應基因列于表3。表3結(jié)果表明，低溫脅迫后烤煙幼苗與光合作用有關(guān)的差異表達基因有35個，其中11個基因表達上調(diào)，24個基因表達下調(diào)。從圖4(b)和表3來看，在PSⅡ上，上調(diào)表達的基因主要有影響PSⅡ中核心編碼蛋白CP47及分子量為44kDa、22kDa等蛋白質(zhì)相關(guān)的基因，這些基因主要控制光合作用中葉綠體類囊體上PsbC、PsbB、PsbS和PsbZ等蛋白；在下調(diào)表達的基因中，部分調(diào)節(jié)PSⅡ中水裂解酶、水氧化蛋白及分子量為10kDa的多肽等相關(guān)基因表達下調(diào)，導致PSⅡ中6個核心編碼蛋白(PsbO、PsbP、PsbQ、PsbR、PsbW和PsbY)表達下調(diào)；下調(diào)表達基因部分降低PSⅠ亞基(PSⅠ-D1、PSⅠ-H、Ⅲ)的前體及PSⅠ反應中心亞基(Ⅱ、IX A、X psaK、XI、XIB)的生成，因此，導致PSⅠ中有9個核心編碼蛋白(PsaD、PsaE、PsbF、PsaG、PsaH、PsaK、PsbL、PsaO和PsaN)相關(guān)基因均在轉(zhuǎn)錄表達水平上顯著下調(diào)。細胞色素b/f復合物 (Cytochrome b6-f complex) 是類囊體膜上可分離出來的多亞基膜蛋白。在本研究中，控制光合電子傳遞的細胞色素b6/f復合物的部分基因Cytb6發(fā)生了上調(diào)表達(PetB蛋白表達上調(diào))、與光合電子傳遞鏈有關(guān)的蛋白PetF、PetH上調(diào)，而PetE蛋白下調(diào)。此外，ATP合成酶復合體有關(guān)的基因c蛋白基因上調(diào)，b蛋白基因下調(diào)及ATP合成酶(如ATP合酶δ鏈，ATP合酶c鏈)發(fā)生上調(diào)表達?？傊诠夂献饔弥邢抡{(diào)表達的24個基因中，涉及到光合作用的原初反應、光合電子鏈的傳遞、光合磷酸化、光合碳同化等主要的代謝通路；部分基因的上調(diào)表達，也提高了烤煙幼苗對低溫脅迫的適應。

圖4 KEGG數(shù)據(jù)庫中光合作用示意圖(a)；低溫脅迫下烤煙幼苗與光合作用相關(guān)的差異表達基因(b)Fig.4 The skechmap of photosynthesis in KEGG database(a); Differential expression genes related photosynthesis of tobacco seedling under chilling stress(b)紅色方框表示基因上調(diào)

基因登IDgeneIDlog2ratio假定功能Putativefunction圖中位置PositionO04397.1|FENR2_TOBAC1.109ferredoxin-NADPreductase,root-typeisozyme,chloroplastic1.18.1.2XP_002271630.1-1.1predicted:hypotheticalprotein3.6.3.14/bBAH11228.12.725ATPsynthaseCF0Cchain3.6.3.14/cXP_002523293.12.194ATPsynthasedeltachain,putative3.6.3.14/DeltAP32980.1|ATPD_TOBAC-1.9ATPsynthasedeltachain,chloroplastic3.6.3.14/DeltAYP_001936513.12.333photosystemII44kDaproteinPsbCADD30625.111.42photosystemIICP47chlorophyllapoproteinPscBAAP03871.1-3.54oxygenevolvingcomplex33kDaphotosystemIIproteinPsbOCAA45699.1-4.4223kDapolypeptideofwater-oxidizingcomplexofpho-tosystemIIPsbPCAA44292.1-4.3123-kDaploypeptideofphotosystemIIoxygen-evolvingcomplexPsbPP18212.2|PSBP2_TOBAC-2.43oxygen-evolvingenhancerprotein2-2,chloroplastic;PsbPXP_002279556.1-1.38predicted:hypotheticalproteinPsbPBAD97359.1-3.33PsbQPsbQAAU03361.1-2.65photosystemIIoxygen-evolvingcomplexprotein3PsbQQ40519.1|PSBR_TOBAC-1.78photosystemII10kDapolypeptide,chloroplastic;SPsbRQ9SMB4.1|PSBS_TOBAC1.039recName:Full=PhotosystemII22kDaprotein,chloroplasticPsbSACU13646.1-3.49unknownPsbWXP_002285325.1-2.02predicted:hypotheticalproteinPsbYYP_001109497.13.512hypotheticalproteinPoptr_cp018PsbZBAA02871.1-3.74PSⅠ-D1precursorPsaDP29302.1|PSAD_NICSY-2.64photosystemⅠreactioncentersubunitⅡ,chloroplas-tic;PsaDQ41228.1|PSAEA_NICSY-3.43photosystemⅠreactioncentersubunitchloroplastic;PsaEQ41229.1|PSAEB_NICSY-2.71photosystemⅠreactioncentersubunitⅣB,chloro-plasticPsaEAAP03872.1-4.11putativephotosystemⅠsubunitⅢprecursorPsaFCBI39855.3-2.2unnamedproteinproductPsaGBAA04634.1-3.62PSⅠ-HprecursorPsaHAAP03873.1-3.15photosystemIreactioncentersubunitXpsaKPsaKAAO85557.1-2.87photosystemIsubunitⅪPsaLACZ72945.1-3photosystemIreactioncentersubunitPsaNCAB75430.1-5.3putative16kDamembraneproteinPsaOP06247.2|CYB6_TOBAC4.362cytochromeb6PetBACV32157.1-2.64chloroplastplastocyaninprecursorpetEACU15698.15.601unknownPetFXP_002275771.11.1predicted:hypotheticalproteinisoform2PetFO04397.1|FENR2_TOBAC1.1ferredoxin-NADPreductase,root-typeisozyme,chloroplasticPetH

2.2.4 低溫脅迫對烤煙幼苗葉片抗氧化能力的影響

5—7 ℃低溫脅迫后K326烤煙幼苗代謝通路中，谷胱甘肽代謝途徑是基因顯著差異表達顯著富集的最主要生化代謝途徑之一。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫中谷胱甘肽代謝圖將差異基因標注在圖5，并將相關(guān)基因信息列于表4。表4結(jié)果表明，低溫誘導烤煙幼苗谷胱甘肽代謝過程差異表達基因共有26個，其中上調(diào)表達的基因有23個，3個基因下調(diào)表達。上調(diào)表達的基因主要是與谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、抗壞血酸過氧化物酶、磷脂過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、6-磷酸葡萄糖酸鹽脫氫酶等酶蛋白有關(guān)的基因。其中，與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相關(guān)的基因有13個發(fā)生了上調(diào)表達，占總上調(diào)表達基因的50.00%；谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽之間的代謝過程中差異基因8個，占總差異基因的29.63%，其中，APIC基因(基因登錄號為P46440.1|GSTF2_TOBAC)上調(diào)表達最顯著，較對照上升近1000倍，C- 7(基因登錄號為CAA45741.1)上調(diào)表達達到500倍，均在清除細胞內(nèi)活性氧及保護細胞抵御活性親電物質(zhì)時起重要作用。

表4 低溫脅迫烤煙幼苗谷胱甘肽代謝差異表達基因的相關(guān)信息

圖5 低溫脅迫下烤煙幼苗的谷胱甘肽代謝過程中的差異表達基因Fig.5 Differential expression genes related to glutathione metabolism of tobacco seedling under chilling stress

3 討論

煙草生長最適溫度為25— 28 ℃。目前，烤煙大多采用工廠化集約漂浮育苗，雖然育苗小環(huán)境有所改善，但受自然氣溫影響仍然很大，當溫度降至12 ℃以下會造成出苗慢、降低出苗率及苗期生長緩慢。南方很多煙區(qū)在早春育苗階段常有“倒春寒”等低溫危害發(fā)生，一般3 d左右，有時甚至達1周，影響煙苗質(zhì)量及移栽后還苗期延長，最終影響煙葉生產(chǎn)中、上等煙的比例及優(yōu)質(zhì)特色煙葉生產(chǎn)。晉艷等研究了低溫脅迫0.5—1.5 h后2個煙草品種(云煙85和K326)幼苗的膜透性、脯氨酸含量、膜保護酶和葉綠素含量變化特點[5]，模擬南方煙區(qū)“倒春寒”特點，低溫脅迫3 d后測定烤煙幼苗光合能力、膜氧化和抗氧化能力，研究結(jié)果對烤煙壯苗培育具有重要參考意義。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫后其葉綠素含量、光合能力顯著下降，細胞膜受損，結(jié)果與短時間處理[5]結(jié)果一致，但膜保護酶活性和抗氧化物質(zhì)(谷胱甘肽和抗壞血酸)含量顯著上升，抗氧化能力加強，植物本身耐低溫能力得到提高。植物在逆境脅迫響應下受到多個基因的調(diào)控，在逆境條件下大量基因表達發(fā)生變化，這些基因?qū)ο鄳婢衬托缘墨@得起到重要作用[15]?；跍y序技術(shù)的數(shù)字化基因表達譜具有高通量和高靈敏性的優(yōu)勢，不需要獲得目標基因序列，可以從全基因組突破同時研究成千上萬個基因的表達，能很好反映生物在生長發(fā)育過程中整個基因組的基因表達變化情況[27- 28]。因此，我們采用該基因表達譜分析技術(shù)分析低溫處理3 d后烤煙幼苗葉片的基因差異表達情況，從中進一步驗證基因表達差異和光合能力、抗氧化能力之間的一致性，發(fā)現(xiàn)大量的上調(diào)和下調(diào)差異表達基因，其中部分基因表達量較高，為進一步利用這些基因提供了理論依據(jù)。

在高等植物中大部分的葉綠素分子都結(jié)合在PSⅠ和PSⅡ的天然色素蛋白復合物上，類囊體膜是光合作用能量轉(zhuǎn)換所需的脂質(zhì)雙層膜，含有捕光及將光能轉(zhuǎn)化為化學能所必需的色素蛋白及酶系統(tǒng)。其中，PSⅡ捕光色素蛋白復合物在類囊體膜上的含量最為豐富,它所結(jié)合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%[29]。通常PSⅠ捕光色素蛋白 (LHC)含有Lhca1、Lhca2、Lhca3 和Lhca4等種蛋白質(zhì)，PSⅡ捕光色素蛋白 (LHCII)含有Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5等蛋白質(zhì)，捕光色素蛋白分子量在20 — 29 kD 之間[30]。內(nèi)囊體膜中有兩種捕光天線葉綠素a/b色素蛋白復合體，PSⅠ捕光天線葉綠素a/b 色素蛋白復合體 (LHCI) 和PSⅡ捕光天線葉綠素a/b色素蛋白復合體 (包括LHCII、CP29 、CP26 、CP24 和CP22)。由于LHCII 結(jié)合有葉片葉綠素總量的50%，在光合作用光能的吸收中具有重要作用。CP29、CP26、CP24 和CP22是PSⅡ捕光天線葉綠素a/b色素蛋白復合體中4種主要的亞復合物，含有β-胡蘿卜素和葉黃素，參與葉黃素循環(huán)，分散過多的激發(fā)能，對抗光抑制，起到保護反應中心的作用，其中CP22和CP29更靠近PSⅡ核心復合物。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫后葉綠素a/b結(jié)合蛋白編碼基因，無論是CP22還是CP29，表達都下調(diào)，說明低溫脅迫后葉片葉綠素捕光能力下降。光合作用的原初反應，即捕光色素分子吸收光能，將能量快速高效地傳遞給光合作用反應中心，進行電荷分離，固定激發(fā)能，經(jīng)過一系列電子傳遞步驟，將能量轉(zhuǎn)化為電化學自由能。PSⅡ反應中心負責光能的轉(zhuǎn)換、電子和質(zhì)子的產(chǎn)生以及分子氧的釋放過程的啟動。葉綠體PsbA和PsbD 基因編碼的D1和D2多肽是PSⅡ RC 的主要功能蛋白，它們結(jié)合著P680，脫鎂葉綠素a和 β-胡羅卜素，并且含有PSⅡ電子傳遞鏈中最重要的組分Z 和D，還為與水裂解相關(guān)的錳簇提供結(jié)合位點[31]。CP47 和CP43 與反應中心的D1 和D2 蛋白緊密相連，除了將外周天線葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCII、CP29、CP27、CP24、CP22)捕獲的激發(fā)能匯集給反應中心外，還具有核心天線的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后煙草CP47(PsbB)和CP43 (PsbC) 相關(guān)基因表達明顯上調(diào)，可能是為了適應天線蛋白基因下調(diào)的結(jié)果，起到一種補償作用。光合作用的開始是從PSⅠ開始。PSⅠ是電子傳遞鏈過程，從初級接受者(Primary acceptor)開始，經(jīng)過鐵氧化還原蛋白(Fd)、細胞色素復合體(Cytochrome Complex)、質(zhì)體藍蛋白(含銅蛋白質(zhì))(Pc)后再回到PSⅠ，本文中PSⅠ相關(guān)調(diào)控差異基因均表現(xiàn)為下調(diào)表達，說明低溫影響電子鏈的傳遞。光合電子傳遞是由反應中心啟動，由電荷分離所導致的，由PSⅡ和PSⅠ串聯(lián)起來進行的，其中細胞色素b6/f復合物位于PSⅡ和PSⅠ兩者之間。本文中低溫導致烤煙細胞色素b6/f復合物上調(diào)，光電子傳遞部分基因上調(diào)，部分基因下調(diào)，這也可能是烤煙幼苗低溫適應的結(jié)果。葉綠素含量高低變化是光合作用重要的影響因素，也會影響葉片對光能的吸收。低溫脅迫3d后烤煙K326多數(shù)葉綠素相關(guān)基因處于下調(diào)，同時，葉綠素含量較對照顯著下降，研究結(jié)果表明葉綠素總含量變化和作為兩種捕光天線葉綠素a/b色素蛋白復合體基因下調(diào)是相對一致的。同時，K326在低溫處理后，其凈光合速率、蒸騰速率、葉片氣孔導度等均顯著下降，說明其光合能力大大下降，與基因表達譜分析結(jié)果一致。

谷胱甘肽是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的活性三肽，具有作為藥物、機體異物的解毒劑、機體抗氧化劑、氨基酸運輸物質(zhì)、輔酶等各種生化作用[32]。尤其是可自發(fā)地或在GPX(谷胱甘肽過氧化物酶)催化下來清除體內(nèi)的活性氧，也可通過谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)催化形成GSX來清除活性物質(zhì)以保護細胞，降低氧化損傷[33]。低溫處理K326后進行基因差異表達分析結(jié)果顯示，葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶、精胺合酶、葉綠體類囊體29kDa蛋白等蛋白質(zhì)有關(guān)的基因均處于下調(diào)表達，說明有機體有一套強大的自我保護及調(diào)控機制來應對環(huán)境脅迫。谷胱甘肽相關(guān)基因的上調(diào)及下調(diào)表達是其更充分發(fā)揮抵御氧化壓力及解毒功能的作用，這種調(diào)控與自我保護機制密切相關(guān)。本文通過測定K326煙草幼苗葉片中自由基生成速率發(fā)現(xiàn)，低溫處理3 d后自由生產(chǎn)速率下降，從差異基因表達情況來看，谷胱甘肽相關(guān)基因多處于上調(diào)(表3)，這和自由基生產(chǎn)速率下降一致。本文谷胱甘肽上調(diào)基因中，主要包含谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、多胺(亞精胺合酶，腐胺氨丙基轉(zhuǎn)移酶)及抗壞血酸過氧化物酶等類型，均與抵御逆境脅迫有關(guān)。谷胱甘肽和Vc含量在低溫處理后顯著上升，說明K326烤煙幼苗通過相關(guān)基因上調(diào)，提高了其清除自由基能力。林元震[34]通過將克隆的葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因轉(zhuǎn)移到煙草中進行低溫脅迫后發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間延長，轉(zhuǎn)化煙草的SOD、POD活性升高而MDA含量下降，說明該基因在煙草中的表達有助于膜保護性酶SOD和POD活性提高及細胞膜穩(wěn)定，進而提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力[34]。通過低溫脅迫處理K326后，其CAT酶活性上升，SOD酶活性顯著上升，POD酶活性則表現(xiàn)為顯著下降，這可能與差異基因表達譜中G- 6-PD基因中部分上調(diào)、部分處于下調(diào)有關(guān)。

植物對低溫脅迫的響應是植物體內(nèi)一個復雜的過程，主要包括感應低溫信號，信號轉(zhuǎn)導，及引起轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)功能性基因的差異表達。植物主要通過氣孔關(guān)閉、滲透性物質(zhì)積累、活性氧清除以及對膜和蛋白結(jié)構(gòu)的保護等一系列反應作為對低溫脅迫的耐受響應。本研究差異表達基因涉及到烤煙幼苗對低溫脅迫響應機制的各個方面。此外，還有大量功能未知基因，這些基因參與多種代謝途徑，功能表達多表現(xiàn)為上調(diào)，少數(shù)表達下調(diào)，部分呈現(xiàn)超過10倍的表達量，這些基因與烤煙幼苗在低溫脅迫下的生理生態(tài)反應將是下一步研究的主要內(nèi)容之一。本研究也獲得了一批與耐寒相關(guān)的基因，尤其是抗氧化相關(guān)的超量表達基因，為耐寒基因克隆及分子機理研究奠定了基礎(chǔ)。

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Expression profiling of genes related to photosynthesis and antioxidant capacity in flue-cured tobacco seedlings subjected to chilling stress

CUI Cui*, WANG Lijuan, ZHOU Qingyuan, TAN Zunfei, QU Cunmin, ZHANG Zhengsheng

CollegeofAgronomyandBiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China

Tobacco is an important economical leaf crop and complex model organism that is cultivated worldwide. Low temperature is the one of major factors causing abiotic damage to flue-cured seedlings; this damage can affect the growth and development of flue-cured tobacco seedlings and can decrease the yield and quality of flue-cured tobacco leaves. Currently, technologies for cultivating seedlings by using water and oxygen have been widely adopted in southern tobacco-cultivating regions. However, temperature is dependent on climate, which is difficult to control artificially. Low temperatures during the early spring season limit the culture of strong seedlings in southern tobacco-cultivation areas. The objective of this study was to analyze physiological and ecological adaptations of flue-cured tobacco seedlings by measuring parameters related to levels of photosynthetic, oxidant, and antioxidant factors in the cell membranes of leaves. We also used digital gene expression profiling technology to analyze the differential expression of genes in flue-cured tobacco seedlings after chilling stress. Seedlings of flue-cured tobacco strain K326 were used as experiment materials. Tobacco seedlings with 5—6 true leaves were divided in two groups. One group of flue-cured seedlings was placed in a light incubator at a low temperature range of 5 ℃ (night) to 7 ℃ (day) for 3 days as chilling stress treatment. Seedlings in the other (control) group remained at the initial temperature and illumination conditions and grew at a normal temperature range of 23 ℃ (night) to 25 ℃ (day), with other similar conditions. After chilling stress for 3 days, total chlorophyll (Chl), chlorophyll a (Chl a), and chlorophyll b (Chl b) contents decreased significantly by 2.88%—6.82%, and the net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs), and transpiration (Tr) decreased significantly by 14.14%—68.50% compared with that of seedlings grown under the favorable temperature. Intercellular CO2concentration (Ci) showed no obvious changes. In terms of the membrane oxidant levels of leaves from flue-cured tobacco seedlings, proline and malondialdehyde (MDA) contents and electrolyte permeability increased significantly by 3.88%—144.22% compared with that of control seedlings, while the oxyradical generation rate decreased significantly by 10.66%. Additionally, the membrane antioxidant capacity of flue-cured tobacco seedlings and the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) increased significantly by 6.07% and 45.64%, respectively, compared with that grown under the favorable temperature, while peroxidase (POD) activity was significantly reduced. The vitamin C (Vc) and glutathione (GSH) contents increased significantly by 197.36% and 14.15%, respectively, compared with that of the control. Under chilling stress conditions, 2357 genes from K326 seedlings were differentially expressed significantly compared with that of seedlings grown under the favorable temperature. Of these, 1673 genes were upregulated, and 684 genes downregulated. Gene ontology analysis revealed that these differentially expressed genes were mainly involved in transcription factors, transmembrane transporter proteins, antioxidant systems, signaling pathways, and others. Gene ontology analysis revealed relationships with the photosystem, photosynthetic membrane, chloroplast, plastid, cytoplasm, membrane, ribosomes, and more. In particular, 524 differentially expressed genes were associated with plastid expression. The molecular functions of these differentially expressed genes were mainly associated with oxidoreductase activity and the antioxidant system of the cell membrane of flue-cured seedlings. Differential expression was also observed for genes involved in biological processes such as response to stress, photosynthesis, light reaction of photosynthesis, hormone-mediated signaling pathways, and more. After analysis of metabolism pathways related to differential gene expression, our results showed that genes related to photosynthesis-antenna proteins and photosynthesis were downregulated, while genes involved in oxidant capacity, such as Vc, GSH, and proline metabolism, were upregulated. Leaves of flue-cured tobacco seedlings suffered oxidant damage under chilling stress condition, but the promotion of antioxidant ability by chilling stress had an active protective effect on flue-cured tobacco seedlings. Therefore, flue-cured seedlings had some capacity to adapt to chilling stress by adjustment of gene expression, which altered pathways involved in photosynthetic, oxidant, and antioxidant metabolism to reduce the damage resulting from the stress conditions. Importantly, the results of gene expression analysis and physiological ecological adaptation were consistent. Hence, it is possible to analyze ecological adaptation and differential gene expression of crops under stress, and such studies will facilitate further analysis of gene ontology functions and gene expression relationships.

flue-cured tobacco; chilling stress; digital gene expression profile; differentially expressed genes

高等學校學科創(chuàng)新引智計劃(B12006); 重慶市自然科學基金項目(cst2011jjA80023); 西南大學博士啟動基金(SWU112074); 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(2362014xk09, XDJK2014C150)

2013- 10- 24;

2014- 07- 03

10.5846/stxb201310242565

*通訊作者Corresponding author.E-mail: cuigreeny@163.com

崔翠，王利鵑，周清元，譚尊飛，曲存民，張正圣.低溫脅迫下烤煙幼苗葉片光合作用和抗氧化能力基因差異表達譜.生態(tài)學報,2014,34(21):6076- 6089.

Cui C, Wang L J, Zhou Q Y, Tan Z F, Qu C M, Zhang Z S.Expression profiling of genes related to photosynthesis and antioxidant capacity in flue-cured tobacco seedlings subjected to chilling stress.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6076- 6089.