布秀娟

大慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)檢驗(yàn)系藥學(xué)教研室，黑龍江大慶163312

肝損傷動(dòng)物模型制作研究進(jìn)展

布秀娟

大慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)檢驗(yàn)系藥學(xué)教研室，黑龍江大慶163312

肝臟疾病是危害人類健康的常見(jiàn)病，因此，建立和完善肝損傷動(dòng)物模型，對(duì)各種肝臟疾病治療藥物的篩選和發(fā)病機(jī)制的研究有著重要的意義。將近年來(lái)肝損傷動(dòng)物模型的相關(guān)進(jìn)展作以綜述和探討。

肝損傷動(dòng)物模型；化學(xué)性肝損傷；藥物性肝損傷；免疫性肝損傷

肝臟疾病是臨床常見(jiàn)的，嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。因此，重中之重是要研發(fā)治療肝臟疾病的有效藥物。在研發(fā)過(guò)程中，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象受空間、時(shí)間、方法乃至道義上的局限，于是，對(duì)各種肝臟疾病治療藥物的篩選與發(fā)病機(jī)制的探究，很大程度上要依賴于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用[1]。建立較完善的肝損傷動(dòng)物模型，對(duì)肝臟疾病的研究有著重要的現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)將近年來(lái)肝損傷動(dòng)物模型的相關(guān)研究進(jìn)展作以綜述和探討。

1 化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型

化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型是通過(guò)化學(xué)性肝毒物質(zhì)，如四氯化碳（CCl4）、D-氨基半乳糖（D-GalN）、硫代乙酰胺（TAA）等致肝損傷。

1.1 CCl4性肝損傷模型

CCl4在肝臟細(xì)胞微粒體內(nèi)的細(xì)胞色素P450的作用下，產(chǎn)生自由基（三氯甲基自由基、三氯甲基過(guò)氧自由基和氯自由基）及一系列氧活性物，使細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生氯烷基化和脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡[2-4]。

CCl4可致急性和慢性肝損傷。劉赴平等[5]采用50%CCl4橄欖油溶液3 mL/kg腹腔注射無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）SD大鼠，造模后24 h、72 h、1周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，急性肝損傷模型鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）/谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平明顯高于對(duì)照組，且造模后24 h和48 h模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率分別為40%和10%，病理切片顯示模型鼠肝臟呈急性肝壞死表現(xiàn)。張海燕等[6]應(yīng)用20%～50%四氯化碳溶液在1.5 mL/kg劑量下腹腔注射可誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、凋亡、壞死及再生等病變，病變穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便。另有宋敏等[7]通過(guò)腹腔注射70 g/L CCl4/橄欖油及自由飲用100 mL/L乙醇水溶液建立了穩(wěn)定的小鼠慢性肝損傷模型，模型組小鼠血清中ALT、AST含量明顯高于對(duì)照組，超氧化物歧化酶（SOD）含量明顯低于對(duì)照組，病理切片顯示模型組小鼠肝臟脂肪細(xì)胞增多，并出現(xiàn)少量纖維化。CCl4肝損傷模型是一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)研究模型[8]，一般認(rèn)為其能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，有著較好的重復(fù)性，但其效果也受如動(dòng)物性別[9]、給藥劑量、給藥途徑[10-11]等因素的影響。

1.2 D-GalN性肝損傷模型

D-GalN是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥，其引起的肝臟病理變化與臨床病毒性肝炎相似。D-GalN可以引起質(zhì)膜損害，在肝細(xì)胞內(nèi)形成尿苷二磷酸-半乳糖胺復(fù)合物，耗竭尿苷三磷酸，致使質(zhì)膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成減少，膜出現(xiàn)損傷；D-GalN也可改變細(xì)胞內(nèi)離子濃度，引起肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少。Ca2+增多使線粒體功能受到抑制，激活磷脂酶，加速氧化自由基產(chǎn)生，加劇肝細(xì)胞損傷[30]。另外D-GalN還可引起肝細(xì)胞的代謝紊亂而導(dǎo)致肝損傷[2]。

Keppler等[12]于1968年首先應(yīng)用D-GalN制備大鼠肝損傷模型。張明[13]通過(guò)小鼠腹腔注射D-GalN（1.8 g/kg）1 mL，對(duì)肝臟造成的損傷程度與乙型肝炎病毒的類似，結(jié)果顯示此方法可制作經(jīng)濟(jì)、有效的肝損傷模型。陳恩強(qiáng)等[14]采用脂多糖聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)了小鼠急性重癥肝炎，結(jié)果表明脂多糖10 μg/kg聯(lián)合D-GalN 500 mg/kg可成功建立12 h存活率較高的急性重癥肝炎小鼠模型，此模型不僅有較好的穩(wěn)定性，而且有較長(zhǎng)的存活時(shí)間，可以輔助研究肝炎發(fā)病機(jī)制，探索重癥肝炎治療新措施。D-GalN肝損傷動(dòng)物模型穩(wěn)定，可以復(fù)制，但也有不可逆性，價(jià)格昂貴等不足之處[15]。

1.3 TAA性肝損傷模型

TAA可以引起自由基過(guò)多，氧化型谷胱甘肽水平升高導(dǎo)致大鼠肝損傷；也可引起肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少，與D-GalN機(jī)制類似。

TAA常用于制作急性肝損傷、肝纖維化模型。魏新智等[16]一次性腹腔注射不同劑量的TAA制作大鼠急性肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)TAA 200 mg/kg的劑量組血清ALT、AST值顯著升高，病理學(xué)顯示肝細(xì)胞變性壞死，而且肝臟病理變化均一。張帥等[17]采用0.03%TAA 2次/周皮下注射SD大鼠，實(shí)驗(yàn)表明在造模第3、6、9周末測(cè)定ALT和AST濃度均明顯升高，誘導(dǎo)了大鼠肝纖維化模型。TAA致大鼠急性肝損傷模型具有良好的重復(fù)性和可行性，目前已成為國(guó)內(nèi)外成熟、常用的肝性腦病模型。

2 藥物性肝損傷動(dòng)物模型

隨著藥物的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多由藥物引起的肝損傷被發(fā)現(xiàn)，如對(duì)乙酰氨基酚、氯丙嗪、異煙肼、四環(huán)素等，也可以此制作肝損傷模型。

2.1 對(duì)乙酰氨基酚肝損傷模型

對(duì)乙酰氨基酚又稱撲熱息痛，是常用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一。在常規(guī)治療劑量時(shí)是相對(duì)安全的，但長(zhǎng)期或過(guò)量使用易造成肝中心小葉壞死，嚴(yán)重會(huì)發(fā)展成為急性肝功能衰竭。對(duì)乙酰氨基酚造成肝損傷的原因一般認(rèn)為與炎癥因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等因素有關(guān)[18]。

450 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚溶液（用40℃0.9%氯化鈉溶液配制）腹腔內(nèi)注射SD大鼠，制成了急性肝細(xì)胞性肝損傷模型[19]。對(duì)乙酰氨基酚是常見(jiàn)的用來(lái)建立肝損傷的模型藥物，但對(duì)小鼠敏感，大鼠不敏感。

2.2 其他藥物性肝損傷模型

異煙肼是常用的抗結(jié)核藥，但具有肝毒性，多用于藥物性肝損傷的研究。楊淑艷等[20]認(rèn)為其致肝損傷機(jī)制為毒性代謝產(chǎn)物及免疫反應(yīng)所致。廖艷等[21]應(yīng)用400 mg/kg異煙肼連續(xù)灌胃14 d制作了大鼠肝損傷模型，并利用互補(bǔ)DNA微陣列技術(shù)研究異煙肼對(duì)大鼠肝臟基因表達(dá)譜的影響，探討異煙肼的肝毒性機(jī)制。四環(huán)素廣譜抗生素亦可引起嚴(yán)重的肝損害。祿保平等[22]以2250 mg/kg四環(huán)素混懸液，按0.2 mL/10 g體重灌胃制成小鼠急性藥物性肝損傷。抗精神病藥氯丙嗪同樣可致肝損傷，伍百賀等[23]給予大鼠75 mg/kg氯丙嗪腹腔內(nèi)注射，肝組織可見(jiàn)肝細(xì)胞有淤膽，復(fù)制了急性膽汁淤積型肝損傷的動(dòng)物模型。

3 免疫性肝損傷動(dòng)物模型

3.1 刀豆蛋白A（ConA）肝損傷模型

ConA又名刀豆凝集素、刀豆素，是一種植物血凝素，具有較強(qiáng)的促有絲分裂作用，有較好的促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的作用，能沉淀肝糖原，凝集馬、豬、羊、狗、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等動(dòng)物及人紅細(xì)胞，還能引起T細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷。林興等[24]小鼠尾靜脈注射20 mg/kg ConA，禁食12 h后制成肝損傷模型。更有研究探討了不同濃度ConA對(duì)小鼠肝損傷的影響，采用尾靜脈注射8、10、12、14、16 mg/kg ConA于白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠（BALb/c小鼠），結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)尾靜脈注射劑量為12 mg/kg ConA第5周獲得了理想的肝纖維化動(dòng)物模型[25]。ConA誘發(fā)的肝損傷模型，制作簡(jiǎn)便，迅速。

3.2 卡介苗加脂多糖（BCG+LPS）肝損傷模型

BCG+LPS的作用機(jī)制首先BCG激活致敏T細(xì)胞，并大量聚積于肝臟，注入LPS后進(jìn)一步激活致敏狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，使其釋放大量細(xì)胞毒性因子，如：白介素、白三烯等造成肝損傷[26]。楊舒婷等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，表明BCG+LPS小鼠尾靜脈注射建立急性免疫性肝損傷模型由于腹腔注射建立免疫性肝損傷模型。此方法造模時(shí)間段，方法簡(jiǎn)單易行，損傷持續(xù)時(shí)間較久，是目前研究肝炎發(fā)病與治療較為理想的模型之一。

4 酒精性肝損傷動(dòng)物模型

目前，國(guó)際上公認(rèn)的酒精性肝損傷模型主要有Tsukamoto-French模型和Lieber-Decarli模型兩種。酒精所造成的肝損傷可分為急性和慢性肝損傷。

4.1 急性酒精性肝損傷

齊慧慧等[28]一次性給予ICR小鼠50%乙醇（6 g/kg）體質(zhì)量灌胃，成功復(fù)制了小鼠急性肝損傷模型，小鼠無(wú)死亡，出現(xiàn)反正反射消失、嗜睡等醉酒狀態(tài)。此模型造模周期短、易復(fù)制、穩(wěn)定性好，是研究急性酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制和篩選藥物的理想模型。

4.2 慢性酒精性肝損傷

雄性SD大鼠按10 mL/kg給予56度白酒灌胃，喂飼基礎(chǔ)飼料。其肝臟病理切片提示肝臟發(fā)生炎癥甚至壞死。結(jié)果提示每日灌胃56度白酒10 mL/kg連續(xù)3周，可建立大鼠慢性酒精性肝損傷模型[29]。此模型簡(jiǎn)單、快速、易于操作。

5 其他

過(guò)量的銅可對(duì)肝臟造成損害，李萬(wàn)立等[31]采用不同濃度的硫酸銅每日灌胃昆明小鼠2次，16周后，觀察肝組織中丙二醛（MDA）的含量明顯升高，而SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性明顯下降；血清ALT和AST活性以及血清、肝臟銅含量明顯升高。此方法可為進(jìn)一步研究銅代謝異常等疾病提供動(dòng)物模型。

經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)展，目前已經(jīng)有多種肝損傷動(dòng)物模型，但由于臨床肝損傷發(fā)病復(fù)雜，現(xiàn)有的肝損傷模型還存在缺陷，因此建立更優(yōu)肝損傷動(dòng)物模型尚需進(jìn)一步的研究和改進(jìn)，為研究肝病發(fā)病機(jī)制、篩選保肝藥物等奠定基礎(chǔ)。

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Progress on animal models of liver injury research

BU Xiujuan
Department of Pharmacy,School of Pharmacy and Medical Examination,Daqing Medical College,Heilongjiang Province,Daqing163312,China

Liver disease is a common disease which affects human health.So,it is great importance for the study of the pathogenesis and the screening of liver disease by the establishment and improvement of liver injury animal models.Progress in recent years on the liver injury animal models will be summarized and explored.

Liver injury animal models;Chemical liver injury;Drug-induced liver injury;Immunological liver injury

R575

A

1673-7210（2014）04（c）-0166-03

2013-11-31本文編輯：蘇暢）