張?chǎng)斡睿?宇，劉文俊，夏曉莉，孫懷昌

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是一種由ASFV引起家豬和野豬的傳染病，具有死亡率高和傳播迅速的特點(diǎn)[1]。1921年該病最早發(fā)現(xiàn)于東非的肯尼亞[2]，以后的幾十年內(nèi)傳播到非洲、歐洲、美洲等許多國(guó)家，并且有繼續(xù)蔓延的趨勢(shì)[3-4]，目前雖然該病尚未傳入我國(guó)，但近年來(lái)鄰國(guó)大面積的流行[5]，使得我國(guó)面臨嚴(yán)重威脅。

本研究選擇了ASFV4種基因，其中ASFV E183L基因編碼的p54蛋白，其抗體具有一定的病毒中和能力[6]；B602L基因編碼的pB602L蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體[7]；K205R基因是一早期轉(zhuǎn)錄基因，其編碼的pK205R蛋白能較早刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[7]；A104L基因編碼的組氨酸樣蛋白，能與ASFV抗體陽(yáng)性血清發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)[8]。構(gòu)建了攜帶這4種基因的重組載體，表達(dá)并純化出重組蛋白pA104L、p54、pK205R和pB602L，分別以這4種重組蛋白包被酶標(biāo)板，ELISA方法篩選可以用于ASFV抗體檢測(cè)的診斷抗原，具體過(guò)程如下。

1 材料與方法

1.1 材料 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-E183L、pGEX-4T-1-B602L、pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R 由 Gulbenkian de Ciência研 究 所 Parkhouse R M教授惠贈(zèng)；原核表達(dá)載體pET-30a（+）、大腸桿菌BL21（DE3），購(gòu)自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、dNTP；Ni-NTA瓊脂糖，購(gòu)自Qiagen公司；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG（H+L），購(gòu)自Earthox公司；OPD，購(gòu)自Sigma公司；ASFV抗體陰性、陽(yáng)性血清由英國(guó)Pirbright研究所提供；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)ASFV Ba71V株基因組序列（GenBank No.U18466.1）設(shè)計(jì)針對(duì)基因E183L和B602L特異性引物：p54F 5′-TAGAATTCCTATTCTCTTCAAGAAAG-3′，p54R 5′-TACTCGAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3′；pB602LF 5′-CTGAATTCATGGCAGAATTTAATATT?GATGAGCTTC-3′，pB602LR 5′-CTGCGGCCGCTTAC AATTCTGCTTTTGTATATAAAATT-3′，其中E183L上游引物從該基因第151核苷酸開(kāi)始。以質(zhì)粒pGEX-4T-1-E183L和pGEX-4T-1-B602L為模板，分別擴(kuò)增一段402bp的E183L基因及B602L基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶EcoRⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、NotⅠ消化后，插入表達(dá)載體pET-30a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-p54和pETB602L，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）。用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切質(zhì)粒pGEX-4T-1-K205R和pGEX-4T-1-A104R，將酶切下的小片段DNA插入載體pET-30a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-K205R和pETA104R，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）。

1.2.2 重組蛋白表達(dá) 將上述4種重組菌按1∶100接種2 mL卡那霉素（50μg/mL）2×YTK培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至4 h，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心沉淀菌體。0.01 moL/L pH值7.6 PBS洗滌2遍，400μL PBS懸浮菌體，加入400μL 2×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，10000 r/min離心5 min后，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠），電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)G-250溶液染色3 h，用脫色液脫色，分析外源基因是否表達(dá)，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)化菌對(duì)照。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物純化及鑒定 按照上述方法按比例進(jìn)行重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，離心沉淀菌體用PBS洗滌2遍，用超聲波裂解儀裂解菌體，10000 r/min離心10 min，分別取部分離心上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定表達(dá)產(chǎn)物是可溶的還是以包涵體形式存在。

按照Qiagen公司說(shuō)明書(shū)，用His親和層析凝膠純化表達(dá)的重組蛋白，ND-1000紫外分光光度計(jì)（Nano Drop公司）定量蛋白濃度，并用0.01 mol/L pH值7.4 PBS調(diào)整最終濃度為1 mg/mL。Western blotting鑒定純化的4種重組蛋白，所用的一抗為200倍56℃滅活2 h的ASFV抗體陽(yáng)性豬血清，二抗為10000倍辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG，最終用DAB顯色。

1.2.4 間接ELISA 純化的抗原包用0.05 mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，包被NUC公司96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃作用2 h；PBST洗滌液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，0.05%Tween-20）洗板2次，200 μL/孔，3 min/次；加入封閉液（0.01 mol/L pH值7.6 PBS，5%脫脂乳粉），200μL/孔，37℃作用1 h；洗板2次后，加入用封閉液200倍稀釋的血清，100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，加入1倍工作濃度的HRP標(biāo)記羊抗豬IgG（H+L），100μL/孔，37℃作用1 h；洗板4次后，吸水紙上拍干板孔中液體，加入新鮮配制的OPD底物溶液，100μL/孔，室溫靜置15 min；加入2 mol/L H2SO終止反應(yīng)，50μL/孔；酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下，讀取每孔吸光值。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體鑒定 將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物插入載體pET-30a（+），限制內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒pET-p54、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R進(jìn)行鑒定，結(jié)果分別切下大小約402 bp、1809 bp、618 bp和315bp的DNA條帶（圖1），確認(rèn)構(gòu)建的重組載體正確。

圖1 重組載體酶切鑒定

2.2 重組蛋白表達(dá) IPTG分別誘導(dǎo)攜帶重組質(zhì)粒pET-A104R、pET-B602L、pET-p54、pET-K205R的大腸桿菌表達(dá)，SDS-PAGE電泳裂解產(chǎn)物，結(jié)果上述4種重組菌分別表達(dá)預(yù)期大小的pA104R、pB602R、p54、pK205R重組蛋白，分子量分別為19 kDa、75 kDa、21 kDa和25 kDa，而誘導(dǎo)及空載體對(duì)照無(wú)相應(yīng)的蛋白條帶。

2.3 重組蛋白純化及鑒定 IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)后，超聲波裂解菌體，分別取離心上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，除重組蛋白pK205R以包涵體形式存在外，其他3種重組蛋白pA104R、pB602R、p54均為可溶性蛋白。分別在尿素變性和非變性條件下進(jìn)行Ni柱親和純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行Western-blotting分析，結(jié)果顯示，純化的重組蛋白pA104R、pK205R、pB602R、p54與ASFV免疫血清均呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖2）。

圖2 純化的重組蛋白W estern-blotting分析

2.4 血清學(xué)診斷抗原篩選

2.4.1 重組蛋白檢測(cè)高滴度的ASFV抗體 將重組蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R梯度稀釋后包被酶標(biāo)板，以ASFV弱毒OURT88/3接種后第20天感染強(qiáng)毒OURT88/1存活下來(lái)的豬血清為檢測(cè)對(duì)象，間接ELISA測(cè)定其抗體，同時(shí)設(shè)立ASFV抗體陰性對(duì)照，結(jié)果重組抗原pK205R、p54和pB602L血清學(xué)反應(yīng)較好，但pB602L與陰性血清有輕微的交叉反應(yīng)（圖3）。

2.4.2 重組蛋白檢測(cè)不同時(shí)期的ASFV抗體 將重組蛋白p54、pB602R、pK205R和pA104R稀釋成2μg/mL，包被酶標(biāo)板，以ASFV弱毒OURT88/3接種后第6、13、19天采集的豬血清為檢測(cè)對(duì)象，間接ELISA測(cè)定其抗體，同時(shí)設(shè)立ASFV抗體陰性對(duì)照，結(jié)果重組抗原p54在13 d時(shí)檢測(cè)效果最好，pK205R次之（圖4）。

圖3 間接ELIS A檢測(cè)高滴度A S FV抗體

圖4 間接ELIS A檢測(cè)A S FV感染后不同時(shí)期的抗體

3 討論

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種復(fù)雜的大DNA病毒，豬或野豬感染后，潛伏期通常為3～15 d，強(qiáng)毒株感染的死亡率可達(dá)到100%，毒力稍弱的毒株感染后表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁等癥狀，低毒株感染出現(xiàn)亞臨床癥狀或僅血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，易與豬其他疾病混淆[1]。OIE認(rèn)為，在ASF流行疫區(qū)和低毒力ASFV感染初期地區(qū)進(jìn)行調(diào)查、診斷，血清學(xué)方法是首推的診斷方法，而以純化的重組蛋白作為檢測(cè)抗原，比病毒感染后的可溶性細(xì)胞裂解更具優(yōu)勢(shì)[9]。

ASFV感染豬巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)至少可表達(dá)100種病毒蛋白，其中約50種能與感染或康復(fù)期豬血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)[10]，2009年，Gallardo等[11]從ASFV感染康復(fù)豬血清中篩選到12種較強(qiáng)免疫原性 抗 原，以其中的 p54、pB602L、pK205R 和pA104L重組蛋白為抗原，分別建立了檢測(cè)ASFV抗體的ELISA方法，田間檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該ELISA方法與OIE推薦的ELISA方法具有較高的檢測(cè)符合率。這些重組蛋白融合標(biāo)簽為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST），由于其分子量較大（26kDa），造成ELISA背景值較高，檢測(cè)時(shí)需要設(shè)立GST本底對(duì)照。本研究對(duì)ASFV E183L、B602L、K205R和A104R基因進(jìn)行了亞克隆，其中的E183L基因，由于前150個(gè)核苷酸編碼疏水性蛋白和無(wú)B細(xì)胞表位蛋白，因此將其切除，并融合上組氨酸（His）標(biāo)簽，以表達(dá)純化的重組蛋白為抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，結(jié)果反應(yīng)背景大大降低，檢測(cè)時(shí)也不需要設(shè)立本底對(duì)照。

用不同抗原建立的間接ELISA分別檢測(cè)ASFV感染后豬血清中的抗體，發(fā)現(xiàn)在感染后的中后期，pK205R、p54和pB602L檢測(cè)效果較好，而在感染早期抗體檢測(cè)時(shí)，p54檢測(cè)效果最好，pK205R次之。由此可見(jiàn)，4種重組蛋白中，p54和pK205R無(wú)論在ASFV感染早期還是中后期，均可用作診斷抗原檢測(cè)相應(yīng)的抗體，這對(duì)今后檢測(cè)ASFV抗體試劑盒的開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

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