鄧 祥, 黃小梅, 吳 狄

(四川文理學院化學與化學工程系,四川達州635000)

近年來,隨著國內農林業(yè)病蟲害的不斷發(fā)生,造成農林業(yè)大量使用農藥.因有機磷農藥(OPs)具有較高的藥效,對植物的藥害小,在人、畜體內一般不積累等特點[l],是目前國內用途最為廣泛的一類農藥,主要用于防治果蔬病、蟲、害.但是,隨著有機磷農藥的大量使用,部分農藥殘留在環(huán)境中來不及分解,從而造成對土壤、水體的嚴重污染.對人類健康產生潛在的威脅.殘留在環(huán)境中的農藥隨著食物鏈進入人體體內,其磷酰基與體內膽堿脂酶的活性部分進行結合,形成磷?；憠A酶從而使其分解乙酰膽堿的能力喪失,導致人體內乙酰膽堿大量積累,并抑制體內乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性,致使神經傳導介質:乙酞膽堿的新陳代謝紊亂,引起中樞神經調節(jié)功能異常,導致運動失調、昏迷、癱瘓甚至導致死亡等癥狀.所以,及時、準確地對OPs殘留進行監(jiān)控與檢測是十分必要的.

有機磷農藥殘留的常用檢測方法主要有:高效液相色譜(HPLC)法[2]、高效液相色譜(HPLC)-質譜(MS)法[3]和氣相色譜(GC)法[4]等.上述方法雖然能對有機磷農藥的殘留情況進行比較準確地檢測,但也存在樣品處理過程復雜,檢測周期長和儀器設備價格昂貴等缺陷,不能滿足現場快速檢測的要求.隨著生物傳感技術的迅猛發(fā)展,越來越多的科研技術工作者著力研發(fā)靈敏度高、方便、快捷、主要用于現場監(jiān)控和檢測的有機磷農藥生物傳感器[5-6].為了排除某些電活性物質的干擾,降低工作電位.各種各樣的電子媒介體被用于生物傳感器中,以期達到提高電極和生物酶之間的電子傳導性能,促進電子的傳遞速率.但是,由于大多數電子媒介體的相對分子質量較小,實驗過程中,分子量較小的電子媒介體極其容易滲漏而進入測試底液中對電極造成污染,從而對電極的響應性能產生影響.為了消除這一影響,部分研究表明將電子媒介體與其他載體相連接以增大分子量降低其滲漏現象[7].碳納米管(MWCNTs)作為一種新型的納米材料,由于其獨特的管狀結構和較強的導電性能,廣泛應用于生物電分析和生物傳感器的研究[8-10].碳納米管能夠縮短其與氧化還原蛋白質中氧化還原中心的距離[11-12],使電子轉移更容易進行.本文選用MWCNTs為模板合成PB包埋MWCNTs的納米棒(PB@MWCNTs).然后將PB@MWCNTs用CS分散,固定到玻碳電極上,然后通過靜電吸附將乙酰膽堿酯酶(AChE)修飾于電極表面,制得的乙酰膽堿酯酶的酶抑制電流型傳感器應用于本實驗有機磷農藥的檢測研究,效果較好.該酶抑制電流型傳感器主要利用PB@MWCNTs良好的導電性、吸附性和生物相容性,實現了對有機磷農藥的檢測.由于納米材料間的協(xié)同作用,充分發(fā)揮了各種材料功效,使該傳感器具有檢測線性范圍寬、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器碳納米管(MWCNTs,中科院成都有機化學有限公司);殼聚糖(CS)、乙酰膽堿(ATCh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、呋喃丹均購自Sigma公司;氯化鉀(KCl)、氯化鐵(FeCl3)、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)等試劑均購于成都科龍試劑有限公司.磷酸鹽緩沖溶液(PBS)通過 KH2PO4-K2HPO4溶液配制而成.實驗用水均為二次蒸餾水,其他試劑均為分析純試劑.TECNAI10型透射電鏡(TEM,荷蘭PHILIPSFEI公司);CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司);FA1004N電子天平(上海菁海儀器公司);,KQ-300VDB型超聲波清洗器超聲清洗機(上海譜振生物科技有限公司);pHS-4C型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司).

1.2 PB@MWCNTs納米棒的制備[13]將5 mg經酸處理過的MWCNTs均勻地分散于1 mL二次蒸餾水中,然后將MWCNTs加入到5.0 mmol/L K3Fe(CN)6、5.0 mmol/L FeCl3和KCl混合溶液中并用3 mol/L HCl調節(jié)至pH約為1.5.攪拌反應20 h后,將溶液離心分離并用二蒸餾水洗滌至中性,即得PB@MWCNTs納米棒.圖1為PB@MWCNTs納米棒的透射電鏡圖(TEM),由圖可見PB納米顆粒已均勻牢固地吸附于碳納米管外管壁.

圖1 PB@MWNTs納米棒的透射電鏡圖Fig.1 The TEM image of PB@MWNTs nanorodes

1.3 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器的制備實驗前,將玻碳電極(GCE)表面用0.5 μm的Al2O3粉末進行拋光處理,并依次用二次蒸餾水、HNO3(1.0 mol/L)、NaOH(1.0 mol/L)、丙酮以及二次蒸餾水各超聲清洗電極5 min.10 mg CS粉末溶解于5 mL質量分數1.0%的HAc溶液中,制得質量分數0.2%的CS溶液,加入5 mg PB@MWCNTs納米棒,攪拌均勻,即制得1 mg/mL CS-PB@MWCNTs懸濁液.取10 μL CS-PB@MWCNTs懸濁液滴涂于玻碳電極表面,室溫晾干.將CS-PB@MWCNTs/GCE電極置于0.3單位/mL AChE溶液中浸泡1 h后取出,用二次蒸餾水沿電極側壁沖洗,氮氣吹干備用.

1.4 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器應用于有機磷農藥的檢測在5.0 mL PBS溶液中加入一定量的ATCh,使其濃度為1.0 mmol/L,攪拌5 min后,在溶液靜置狀態(tài)用循環(huán)伏安法進行掃描,記錄下掃描過程中產生的峰電流;另取一份相同的ATCh溶液,同時加入一定量的已知濃度的有機磷農藥樣品,待抑制時間達到10 min后,檢測有機磷農藥的不同濃度情況下對峰電流的影響.利用公式計算即可得到有機磷農藥對傳感器的抑制率.

1.5 實際樣品準備與測試采摘新鮮的卷心菜、生菜和小白菜.將蔬菜剪碎,稱取其試樣10.00 g,置于50 mL燒杯中,加入10 mL水和20 mL丙酮,用超聲儀超聲15 min.然后將超聲萃取得到的懸濁液在離心機上離心分離后,取上層清液進行檢測,根據由標準溶液作出的農藥工作曲線,可以檢測出蔬菜上的農藥含量.

2 結果與討論

2.1 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器的電化學行為實驗研究了傳感器在pH 7.1的PBS中不同掃速下的循環(huán)伏安圖.其結果見圖2所示,掃描速度從20 mV/s到300 mV/s,氧化還原峰電流隨著掃描速度的增大而增大,并且由圖中可知峰電流與掃描速度的平方根成線性關系,由此可見該電極反應受表面擴散的控制.

2.2 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器檢測機理有機磷農藥對AChE的催化活性具有抑制作用,導致AChE對底物催化產生的ATCh濃度下降,電流減小[14].同時隨著有機磷農藥質量濃度的不斷增大,有機磷農藥對酶電極的抑制率也不斷增大.所以,通過比較AChE水解產生ATCh的氧化電流大小,可以計算得到有機磷農藥對ATCh的抑制率,同時可以用來計算有機磷農藥的濃度.ATCh的抑制率可由[15-16]

計算得出,式中,A指酶抑制率(與農藥殘留具有正相關性),I0為ATCh傳感器對一定質量濃度的ATCh產生的穩(wěn)態(tài)響應電流(空白電流),I指被毒劑抑制酶電極穩(wěn)態(tài)響應電流.

圖2 傳感器在pH 7.1的PBS中不同掃速的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of the AChE/CS-PB@MWNTs/GCE modified electrode in pH 7.1 PBS solution at different scan rates

圖3 電位對電流響應的影響Fig.3 Effect of potential on the amperometric response of the sensor to 1.0 mmol/L ATCh

2.3 測定條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的影響 在實驗中還考察了磷酸緩沖液的pH值對酶傳感器催化ATCh電流響應的影響.在 pH值7.0～8.0之間,AChE催化活性較高[17],但pH值的增大,會導致有機磷發(fā)生水解,故選擇pH值7.1的PBS緩沖液作為測試底液.

2.3.2 工作電位優(yōu)化 實驗考察了不同工作電位對酶傳感器電流響應的影響,實驗結果如圖3所示.隨著工作電位的逐漸增大,電流響應也不斷增強,當工作電位達到0.5 V后電流的增大情況趨于穩(wěn)定.由于電位過高會影響傳感器的抗干擾能力,同時傳感器使用壽命也會降低[18],所以實驗中選擇0.5 V為工作電位.

2.3.3 底物濃度的影響 底物濃度會影響檢測的穩(wěn)定時間,底物濃度太小,無法確保每次測量的順利完成;底物濃度太大,又會造成殘留,對第二次的檢測帶來影響.對底物濃度進行了優(yōu)化選取,如圖4可見,0.50 mmol/L和2.0 mmol/L的底物無法達到穩(wěn)態(tài)的電流,以1.0 mmol/L比較適宜.

圖4 不同濃度的硫代乙酰膽堿(底物)對應的電流-時間關系曲線Fig.4 Acetylthiocholine different concentrations(substrate)corresponds to the I-t curve

2.4 AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器對硫代乙酰膽堿的線性范圍及其酶動力學研究在優(yōu)化實驗條件下,圖5為AChE/CS-PB@MWCNTs/GCE傳感器對不同濃度硫代乙酰膽堿的電流響應及工作曲線.圖5中顯示了在PBS中,連續(xù)加入不同濃度的硫代乙酰膽堿,響應電流和硫代乙酰膽堿濃度的關系.由此可知,該傳感器對硫代乙酰膽堿檢測的線性范圍為 1.68×10-5～4.25×10-3mol/L,相關系數為0.999 2.

根據圖5中傳感器對硫代乙酰膽堿線性響應,利用Lineweaver-Burk公式[19]

得到乙酰膽堿酯酶的表觀米氏常數Km為0.52 mmol/L.較低的米氏常數,說明通過鏈接反應固定的乙酰膽堿酯酶保持了良好的酶動力學響應,并且符合米氏動力學方程.

圖5 連續(xù)改變不同濃度的硫代乙酰膽堿后的I-t響應及工作曲線Fig.5 Amperometric response of AchE/CS-PB@MWNTs/GCE on the addition of different concentrations of ATCh at 0.5 V in 1.0 mmol/L PBS(7.1)

2.5 農藥的測定首先考察孵育時間對OPs抑制AChE效果的影響,由圖6可見,從0～10 min內OPs對酶的抑制率增加迅速,隨后抑制率的變化趨于穩(wěn)定.即使對于極低濃度的呋喃丹,10 min的孵育時間足以使農藥對酶產生10%的抑制率.為了提高此方法對OPs農藥的檢測效率,實驗過程中的孵育時間以10 min作為標準.檢測了不同濃度下有機磷農藥呋喃丹對AChE活性的抑制率.由圖7可見,該酶傳感器對有機磷農藥吠喃丹的檢測范圍為6～80 nmol/L,由于有文獻報道10%的抑制率(I%)所對應的抑制劑濃度可以定義為理論檢測限[20],因此該傳感器對有機磷農藥呋喃丹的檢測限為3 nmol/L.

圖6 不同抑制時間對傳感器電流響應的影響Fig.6 The effect of the inhibition time on the response of the sensor

2.6 傳感器的穩(wěn)定性將制備好的酶傳感器懸于PBS緩沖溶液上方,置于4℃冰箱中保存,一周內傳感器對ATch的響應無明顯變化,15 d后,響應電流下降了7.8%,30 d后,響應電流仍保持為86.5%,此結果表明,該酶傳感器的穩(wěn)定性能良好,使用壽命較長.

3 結論

本文以殼聚糖(CS)為交聯劑,研究制備了PB@MWCNTs納米棒修飾的乙酰膽堿酯酶傳感器,通過酶抑制法對OPs殘留進行了檢測,對有機磷農藥呋喃丹的檢測限為3 nmol/L.制備的PB@MWCNTs納米棒具有大的比表面積、好的導電性和優(yōu)良的生物兼容性,使該傳感器具有檢測限低、穩(wěn)定性好、靈敏度高及使用壽命長等優(yōu)點,并對其它OPs也有較好的響應.因此,本方法在快速檢測OPs殘留的應用中有著廣闊的前景.

圖7 不同濃度呋喃丹對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率Fig.7 The inhibition rate of the acetylcholinesterase on the sensor with different concentrations of carbofuran

致謝四川文理學院特色植物開發(fā)研究四川省高校重點實驗室項目(SCTZ201305)對本文給予了資助,謹致謝意.

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